乙酰乳酸合成酶（ALS）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

貨號(hào)：BC5525

規(guī)格：50T/24S、100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

50T溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前將試劑一A，試劑一B溶于試劑一C中，充分溶解。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑三：臨用前將試劑三A，試劑三B溶于試劑三C中，充分溶解。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融。

3、 試劑六：臨用前加入1mL無(wú)水乙醇溶解。-20℃可保存4周。

4、 試劑六工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑六：試劑六稀釋液=0.1mL：0.7mL（共0.8mL，8T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。當(dāng)天用完。

5、 標(biāo)準(zhǔn)品：100μmol/mL 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)液（即10⁵ nmol/mL 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)液）。

6、 100nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取10⁵ nmol/mL 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)液50μL和950μL蒸餾水混合，即5000nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；再取20μL 5000nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和980μL蒸餾水混合，即100nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

100T溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前將試劑一A，試劑一B加入試劑一C中，充分溶解。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑三：臨用前將試劑三A，試劑三B溶于試劑三C中，充分溶解。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融。

3、 試劑六：臨用前加入2mL無(wú)水乙醇溶解。-20℃可保存4周。

4、 試劑六工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑六：試劑六稀釋液=0.1mL：0.7mL（共0.8mL，8T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。當(dāng)天用完。

5、 標(biāo)準(zhǔn)品：100μmol/mL 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)液（即10⁵ nmol/mL 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)液）。

6、 100nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取10⁵ nmol/mL 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)液50μL和950μL蒸餾水混合，即5000nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；再取20μL 5000nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和980μL蒸餾水混合，即100nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，ALS，EC 4.1.3.18)，又稱乙酰羥基酸合成酶(Acetohydroxyacid synthase，AHAS)。ALS存在于植物生長(zhǎng)的過程中，是誘導(dǎo)支鏈氨基酸(Ile、Leu、Val)生物合成過程中第一階段的關(guān)鍵酶。

ALS催化丙酮酸生成乙酰乳酸，乙酰乳酸在一定條件下脫羧生成乙偶姻，乙偶姻在堿性環(huán)境下與肌酸和α-萘酚反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，在525nm下有最大吸光值。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、蒸餾水、病、無(wú)水乙醇和硫酸銨。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：2~4的比例（建議稱取約0.5g到1g組織，加入試劑一定容至2mL），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心20min。取1mL上清，轉(zhuǎn)移至新的2mL EP管中。

2. 在取出的上清中加入約0.5g硫酸銨，充分溶解后4℃靜置2h。然后15000g 4℃離心20min，棄掉上清。沉淀中加入0.5mL試劑二，充分溶解冰上待用（若按蛋白濃度計(jì)算，則用此粗酶液自行測(cè)定蛋白濃度）。

二、測(cè)定步驟

1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至525nm，可見分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

4、在1.5mLEP管中按下表步驟加樣：

三、乙酰乳酸合成酶活性計(jì)算

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：37℃每mg組織蛋白每小時(shí)催化產(chǎn)生1nmol乙酰乳酸定義為一個(gè)酶活力單位。

ALS活性（U/mg prot）= C_{標(biāo)準(zhǔn)}×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×V_酶促÷（Cpr×V_樣）÷T×F= 2.1×x÷Cpr×F

按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：37℃每g組織每小時(shí)催化產(chǎn)生1nmol乙酰乳酸定義為一個(gè)酶活力單位。

ALS活性（U/g 質(zhì)量）= C_{標(biāo)準(zhǔn)}×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×V_酶促÷（W÷2÷V_提取×V_樣）÷T×F= x×2.1÷W×F

V_酶促：37℃反應(yīng)體系體積，0.42mL；V_提取：加入的試劑三體積，0.5mL；V_樣：加入的樣本體積，0.2mL；T：37℃反應(yīng)時(shí)間，1h；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2：2mL 樣本勻漿取1mL；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、 如果?A_測(cè)定大于1，可以對(duì)樣品進(jìn)行稀釋或者縮短37℃反應(yīng)時(shí)間；測(cè)定吸光值或?A_測(cè)定小于0.01，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)37℃反應(yīng)時(shí)間。最終計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

稱取0.5037g胡蘿卜組織，按照前處理步驟操作進(jìn)行提取酶液，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算?_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.308-0.198=0.11，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.671-0.173=0.498，帶入公式計(jì)算：

ALS活性（U/g 質(zhì)量）= 210×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F=92.090 U/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] George, MouradJohn, King. Effect of four classes of herbicides on growth and acetolactate-synthase activity in several variants of Arabidopsis thaliana[J]. Planta, 1992, 188(4):491-497.

[2] Hwang I T , Ko Y K ,  Kim T J , et al. Structure–Activity Relationships of Acetolactate Synthase Inhibition among New Benzenesulfonylureas in Rice (Oryza sativa) and Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli var. oryzicola)[J]. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2000, 68(3):166-172.

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BC4160/BC4165 脯*酸脫氫酶（RroDH）活性檢測(cè)試劑盒

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