土壤幾丁質(zhì)酶活性檢測試劑盒說明書

                                           微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC1935

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：自備甲苯。

2、 試劑三：懸濁液，使用前搖勻。

3、 試劑四剛從低溫（2-8℃）條件取出會有晶體析出，加熱使其溶解即可。

4、 試劑五：臨用前取1瓶加入12mL試劑五B，充分溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。用不完的試劑2-8℃可以保存4周。

5、 標(biāo)準(zhǔn)液：5mg N-乙酰氨基葡萄糖。臨用前加入1mL試劑二配制成5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，即5000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃可以保存4周。

產(chǎn)品說明：

幾丁質(zhì)來源非常豐富，是自然界中僅次于纖維素的第二大類生物高聚物，由于其分解非常緩慢而大量堆積容易造成環(huán)境嚴(yán)重污染。幾丁質(zhì)酶是影響土壤中氮礦化的一種重要的酶，其分解幾丁質(zhì)控制著氮循環(huán)的關(guān)鍵步驟。

幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖與堿共熱產(chǎn)生的中間化合物可進(jìn)一步與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)產(chǎn)生顯色物質(zhì)，該顯色物質(zhì)在585nm處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、旋渦振蕩混勻儀、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽、30-50目篩、蒸餾水與甲苯（不允許快遞）、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

新鮮土樣風(fēng)干，過30-50目篩。 稱取約0.1g土樣，加入0.05mL試劑一，混勻，常溫靜置15min。靜置結(jié)束后，加入0.2mL試劑二與0.4mL試劑三，37℃振蕩反應(yīng)24h，8000rpm，4℃離心10min（若離心后上清中仍有雜

質(zhì)，建議將上清再次離心，至澄清），取上清液置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至585nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：臨用前將5000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用試劑二稀釋80倍至62.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。取25μL 5000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加1975μL試劑二，充分混勻，配制成62.5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實驗中每管需要100μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

3、 在EP管中進(jìn)行以下操作：

三、土壤幾丁質(zhì)酶活性計算

酶活性定義：37℃條件下，每克土壤每天分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

土壤幾丁質(zhì)酶活性（U/g 土樣）=（ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)）×V反總÷W÷T=40.625×ΔA測定 ÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管的濃度，62.5μg/mL；V反總：樣本處理總體積，0.65mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，1d。

注意事項：

1. 反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行比色。

2. 試劑五有一定的毒性，試驗操作時做好個人防護(hù)。

3. 當(dāng)A測定大于1時，建議將樣本上清液用試劑二稀釋后再進(jìn)行測定。

實驗實例：

1、 取0.1g土樣1按照測定步驟操作，用96孔板測得數(shù)據(jù)后計算ΔA測定=A測定-A對照=0.098-0.051=0.047，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)- A空白=0.612-0.049=0.563。根據(jù)公式計算酶活得：

土壤幾丁質(zhì)酶活性（U/g 土樣）=40.625×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W= 40.625×0.047÷0.563÷0.1=33.9 U/g 土樣。

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