輔酶 I NAD (H)含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

可見分光光度法

貨號：BC5190

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 NAD標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.5 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

2、 NADH標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

產(chǎn)品說明：

輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式，在生物氧化中起傳遞氫的作用。氧化型輔酶I又稱煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脫氫酶的輔酶，它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會將脫下的氫遞給NAD，使之成為NADH（還原型輔酶I）。而NADH則會作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學(xué)滲透偶聯(lián)的方式，合成 ATP。NAD(H)在機體內(nèi)有重要的生理意義，與物質(zhì)代謝、能量代謝、抗細胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)。體內(nèi)輔酶I含量降低會導(dǎo)致細胞損傷或衰亡。

分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD⁺和NADH，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用WST-1檢測。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋，研缽/勻漿器、超聲破碎儀、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、血清（漿）中NAD⁺和NADH的提?。?/span>

NAD⁺的提取：建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

NADH的提?。?/span>建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5 mL堿性提取液，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

2、組織中NAD⁺和NADH的提?。?/span>

NAD⁺的提?。?/span>建議取0.1g組織質(zhì)量，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

NADH的提?。?/span>建議取0.1 g組織質(zhì)量，加入0.5 mL堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

3、細胞或細菌中 NAD⁺ 和 NADH 的提?。?/span>

NAD⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，離心棄上清，建議500萬細胞或者細菌加入0.5mL酸性提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲3s，停10s，重復(fù)30次），煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

NADH的提取：建議500萬細胞或者細菌加入0.5mL堿性提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲3s，停10s，重復(fù)30次），煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清，冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至450 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 NAD標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水稀釋為0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.019、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。0nmol/mL即為空白管（A_空）。

3、 NADH標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水稀釋為0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.019、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。0nmol/mL即為空白管（A_空）。

4、 稀釋表

5、 在EP管中按順序加入下列試劑：

混勻， 450nm下比色，讀取吸光值，NAD⁺的記為：ΔA_NAD= A₂- A₁，NADH的記為ΔA_NADH= A₂’- A₁’，NAD標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA _{NAD標(biāo)}= A_標(biāo)-A空白管。NADH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA _{NADH標(biāo)}= A_標(biāo)’-A空白管。（標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次，每個測定管需設(shè)一個對照管）

三、NAD⁺和NADH含量計算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

（1） NAD⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y₁，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定代入方程得到x₁（nmol/mL）。

（2） NADH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x₂，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y₂，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA′代入方程得到x₂（nmol/mL）。

2、NAD⁺和NADH含量計算

（一）NAD⁺含量計算

（1） 按液體體積計算：NAD⁺含量(nmol/mL）= x₁×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₁

（2） 按樣本蛋白濃度計算 NAD⁺ (nmol/mg prot）= x₁×V提取÷(V提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計算NAD⁺含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₁×V提取÷W= x₁÷W 

（4） 按細胞數(shù)量計算：NAD⁺含量(nmol/10⁴ cell）= x₁×V提取÷500=0.002×x₁

（二）NADH含量計算

（1） 按液體體積計算：NADH含量(nmol/mL）= x₂×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₂

（2） 按樣本蛋白濃度計算 NADH (nmol/mg prot）= x₂×V提取÷(V提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計算NADH含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₂×V提取÷W= x₂÷W 

（4） 按細胞數(shù)量計算：NADH含量(nmol/10⁴ cell）= x₂×V提取÷500=0.002×x₂

V提取：加入提取液體積，1mL；V血清：血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣

本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、反應(yīng)過程中注意避光。

2、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。同步修改計算公式。

實驗實例：

1. NAD⁺的測定：稱取 0.1g 冬青葉片，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.113-0.089=0.024，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.034，NAD⁺含量得：

NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.34 nmol/g 質(zhì)量。

NADH的測定：稱取 0.1g 冬青葉片，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.250-0.168=0.082，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.186，NADH含量得：

NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=1.86 nmol/g 質(zhì)量。

2. NAD⁺的測定：稱取 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.068-0.045=0.019，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.025，NAD⁺含量得：

NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.25nmol/g 質(zhì)量。

NADH的測定：稱取 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.217-0.118=0.099，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.224，NADH含量得：

NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=2.24 nmol/g 質(zhì)量。

3. NAD⁺的測定：取0.1mL馬血清，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.113-0.074=0.039，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.5982x+0.0038,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.059，NAD⁺含量得：

NAD⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.59 nmol/g 質(zhì)量。

NADH的測定：取0.1mL馬血清，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，玻璃比色皿測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.120-0.097=0.023，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.4452x-0.0008,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.053，NADH含量得：

NADH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=0.53 nmol/g 質(zhì)量。

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