3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號: BC2210
規(guī)格: 25T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑三：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。根據(jù)用量按照試劑三:蒸餾水為3:100的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2. 工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，根據(jù)需要取一定的量37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）預(yù)熱10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：
GAPDH（EC1.2.1.12）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，與糖異生途徑、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。

1. 磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3-二磷酸甘油酸和NADH生成3-磷酸甘油醛、無機磷和NAD⁺，340nm處測定NADH的減少量可反映GAPDH活性的高低。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測。
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
血清（漿）：直接檢測。
二、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：

三、GAPDH酶活計算
1、按樣本蛋白濃度計算
酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=1072×ΔA÷Cpr
2、按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=1072×ΔA÷W
3、按照細菌或細胞數(shù)量計算
酶活定義：每10⁴個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷T=2.14×ΔA
4、按照血清（漿）體積計算
酶活定義：每mL樣本每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T= 1072×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：5min；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
注意事項：

1. 當(dāng)A1小于0.8或ΔA大于0.7時，建議將樣本稀釋后再進行測定。

2. 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.01。

實驗實例：

1. 取0.1g兔腎臟加入1mL提取液，進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=0.815-0.158=0.657，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.656，按樣本質(zhì)量計算酶活得：GAPDH酶活（U/g質(zhì)量）=1072×ΔA÷W=7032.32 U/g質(zhì)量。

2. 取0.1g三葉草加入1mL提取液，進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.026-1.017=0.009，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.008，按樣本質(zhì)量計算酶活得：GAPDH酶活（U/g質(zhì)量）= 1072×ΔA÷W=85.76 U/g質(zhì)量。

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