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  • α-甘露糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法
產(chǎn)品名稱:

α-甘露糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法

產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價(jià)格:
廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時(shí)間: 2024-07-07
有效期
6個(gè)月
儲(chǔ)存條件
-20℃
單位

推薦
若使用96孔板測(cè)定,需使用96孔UV板,推薦貨號(hào)YA0602
α-甘露糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法
英文名稱
α-Mannosidase(α-man)Activity Assay kit
檢測(cè)方法
微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
規(guī)格
100T/48

產(chǎn)品概述

品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
分子式詳詢純度詳詢
分子量詳詢貨號(hào)BC5045
規(guī)格100T/48S供貨周期現(xiàn)貨
主要用途α-甘露糖苷酶活性檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合

α-甘露糖苷酶(α-man)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

貨號(hào)BC5045

規(guī)格100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

試劑名稱

規(guī)格

保存條件

提取液

液體110 mL×1

2-8℃保存

試劑一

液體15 mL×1

2-8℃保存

試劑二

粉劑×2

-20℃保存

試劑三

液體8 mL×1

2-8℃保存

試劑四

1.5mL×1

2-8℃保存

標(biāo)準(zhǔn)品

液體1mL×1

2-8℃保存

溶液的配制:

1、 試劑二:臨用前每支加入0.5mL 試劑四溶解,溶解后的試劑在-20℃分裝保存,可以保存4周。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品:5mmol/L的對(duì)硝基 苯*標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明

α-man分布廣泛、種類繁多,在真核生物胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體中都有發(fā)現(xiàn),不同種類、功能的α-man共同參與N-聚糖的修飾過(guò)程。

α-man和特定底物發(fā)生反應(yīng),其生成物405nm處有特征吸收峰,根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出α-man活性。

注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、勻漿器/研缽、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟

一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))

1、組織:按照組織質(zhì)量(g)︰提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1 g組織,加入1 mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后12000 g,4℃,離心10 min,取上清置于冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞或細(xì)菌:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1 mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌(功率200 W,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3 min);然后15000 g4℃,離心10 min,取上清置于冰上待測(cè)。

3、液體:直接檢測(cè)。若有渾濁可以離心后測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405 nm分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 5mmol/L的對(duì)-硝基 苯*標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.625、0.3125、0.156250.078、0.039、0.01950.01 mmol/L

的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 操作表:(1.5 mL離心管或者96孔板中)

試劑名稱(µL

測(cè)定

對(duì)照

標(biāo)準(zhǔn)管

空白管

樣本

25

25

-

-

試劑一

110

125

125

125

試劑二

15


-

-

標(biāo)準(zhǔn)溶液

-

-

25

-

蒸餾水




25

混勻,37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min

試劑三

50

50

50

50

混勻,吸取200 µL于微量玻璃比色皿或96孔板中,測(cè)定405 nm處吸光值A,分別記為A對(duì)照管、A測(cè)定管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管。計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管,標(biāo)準(zhǔn)曲線、空白管只需檢測(cè)1-2次。

三、α-甘露糖苷酶活性計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸,其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)方程ykx+b,將ΔA帶入方程得到xmmol/L,即μmol/mL)。

2、 α-甘露糖苷酶活性的計(jì)算:

1)按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義:每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活(U/mg prot=x×V÷V×Cpr÷T×F= x×0.1÷ Cpr×F

2)按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義:每g樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活(U/g質(zhì)量)=x×V÷W÷V÷V提?。?/span>÷T×F= x×0.1÷W×F

3)按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

酶活定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 μmol 對(duì)-硝基 苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活(U/104 cell= x×V÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V提取)÷T×F
= x×0.1÷ 細(xì)胞數(shù)量(萬(wàn)個(gè))×F

4)按液體體積計(jì)算

酶活定義:每mL樣本每分鐘產(chǎn)生1 μmol對(duì)-硝 基苯*為1個(gè)酶活力單位。

α-甘露糖苷酶酶活(U/mL)=x×V÷V÷T×F= x×0.1×F

V提取:提取液體積,1 mL;V樣:加入的樣本體積,0.025 mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL,蛋白濃度自行測(cè)定;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,10 min; F:稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)

1、如果測(cè)定吸光值A1.5ΔA1,建議稀釋樣本后再測(cè)定,計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù);如果測(cè)定吸光值較低或接近空白OD值,建議增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定。

 

實(shí)驗(yàn)實(shí)例

1、 稱取0.1 g兔子肝臟組織,加入1 mL提取液,冰浴勻漿,12000 g,4℃條件下離心10 min;取上清置于冰上待測(cè)。使用96孔板按照測(cè)定步驟操作,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.404-0.309=0.095,標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037,計(jì)算x=0.0669,按公式計(jì)算活性:

α-甘露糖苷酶活(U/g 質(zhì)量= x×0.1÷W×F = 0.0669 U/g質(zhì)量

2、 稱取0.1 g綠蘿葉片,加入1 mL提取液,冰浴勻漿,12000 g,4℃條件下離心10 min;取上清置于冰上待測(cè)。使用96孔板按照測(cè)定步驟操作,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.179-0.159=0.02,標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037,計(jì)算x=0.0119,按公式計(jì)算活性:

α-甘露糖苷酶活(U/g 質(zhì)量)= x×0.1÷W×F = 0.0119 U/g質(zhì)量

3、 0.025mL牛血清按操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn),使用96孔板按照測(cè)定步驟操作,計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管=0.107- 0.086=0.021標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.3642x+ 0.0037,計(jì)算x=0.0127,按公式計(jì)算活性:

α-甘露糖苷酶活(U/g 質(zhì)量)= x×0.1÷W×F = 0.0127 U/mL

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