硝酸還原酶（NR）活性檢測(cè)試劑盒（Griess顯色法）說明書

微量法

貨號(hào)：BC4965

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 誘導(dǎo)液：將誘導(dǎo)劑儲(chǔ)備液用蒸餾水10倍稀釋后使用，即取10 mL誘導(dǎo)劑儲(chǔ)備液加90 mL蒸餾水，充分混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

2、 試劑二：加入1mL蒸餾水，-20℃分裝保存，可以-20℃保存2周。臨用前用蒸餾水將試劑二稀釋50倍，備用，即取10 μL試劑二加入490 μL蒸餾水混勻。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 μmol/mL亞硝 *準(zhǔn)溶液。臨用前將用蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋100倍得到0.1 μmol/mL的亞硝 *標(biāo)準(zhǔn)液，備用。

產(chǎn)品說明：

NR（EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，也是誘導(dǎo)酶，對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO₃^ˉ +NADH+H^＋→NO_2ˉ+NAD^＋+H₂O。在酸性條件下，產(chǎn)生的NO₂^ˉ能夠參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物，這種紫紅色化合物在540 nm處有吸收峰，540 nm下吸光值的變化即可表示酶活。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織前處理：

（1） 取適量誘導(dǎo)液于燒杯中，將新鮮標(biāo)本洗凈，濾紙吸干，放入誘導(dǎo)液中（淹沒即可），避光浸泡2 h，取出樣本，濾紙吸干后，-20℃冷凍30 min，取出樣本，濾紙吸干。（根據(jù)需要進(jìn)行誘導(dǎo)處理，一般不需要誘導(dǎo)處理，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有活性則需要進(jìn)行誘導(dǎo)處理）

（2） 按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為1:5~10的比例(稱取約0.1 g樣本，加入1 mL提取液)，冰浴研磨，8000g，4℃離心10 min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞或細(xì)菌的前處理：

先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定：

三、NR活性計(jì)算

NR活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每小時(shí)每mg組織蛋白催化產(chǎn)生1 μmol NO₂^-的量為1個(gè)NR活力單位。

NR活力（U/mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×V樣本÷（V樣本×Cpr）÷T×F

= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷Cpr×F

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每小時(shí)每g組織催化產(chǎn)生1 μmol NO₂^-的量為1個(gè)NR活力單位。

NR活力（U/g 質(zhì)量）=C標(biāo)準(zhǔn)×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×V樣本÷（W×V樣本÷V提?。?/span>÷T×F

= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷W×F

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活定義：每小時(shí)每1萬個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌催化產(chǎn)生1 μmol NO₂^-的量為1個(gè)NR活力單位。

NR活力（U/10⁴ cell）

=C標(biāo)準(zhǔn)×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）×V樣本÷（細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×V樣本÷V提?。?/span>÷T×F

= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×F

C標(biāo)準(zhǔn)：亞硝 *標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.1 μmol/mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1 mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5 h；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.02 mL；細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量：以萬計(jì)；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 吸光度大于1時(shí)，建議用提取液稀釋樣本，注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

2. 嚴(yán)格按照樣本測(cè)定表格列出順序加入試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1 g綠蘿葉片加入1 mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，離心取上清按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得A測(cè)定=0.078、A對(duì)照=0.070、A標(biāo)準(zhǔn)=0.268、A空白=0.046，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NR活力（U/g 質(zhì)量）= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷W= 0.0721 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1 g洋桔梗葉片加入1 mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，離心取上清按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得A測(cè)定=0.088、A對(duì)照=0.064、A標(biāo)準(zhǔn)=0.268、A空白=0.046，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NR活力（U/g 質(zhì)量）= 0.2×（A測(cè)定-A對(duì)照）÷（A標(biāo)準(zhǔn)-A空白）÷W= 0.216 U/g 質(zhì)量。

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