品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC4960 |
規(guī)格 | 50T/24S | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 硝酸還原酶(NR)活性檢測 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
硝酸還原酶(NR)活性檢測試劑盒(Griess顯色法)說明書
可見分光光度法
貨號:BC4960
規(guī)格:50T/24S
產(chǎn)品組成:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
誘導(dǎo)劑儲備液 | 液體50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體12 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 誘導(dǎo)液:將誘導(dǎo)劑儲備液用蒸餾水10倍稀釋后使用,即取10 mL誘導(dǎo)劑儲備液加90 mL蒸餾水,充分混勻。現(xiàn)配現(xiàn)用。
2、 試劑二:加入1mL蒸餾水,-20℃分裝保存,可以-20℃保存2周。臨用前用蒸餾水將試劑二稀釋50倍,備用,即取10 μL試劑二加入490 μL蒸餾水混勻。
3、 標(biāo)準(zhǔn)品:10 μmol/mL亞硝*標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前將用蒸餾水標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋100倍得到0.1 μmol/mL的亞硝*標(biāo)準(zhǔn)液,備用。
產(chǎn)品說明:
NR(EC 1.7.1.3)廣泛存在于植物中,是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶,也是誘導(dǎo)酶,對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。NR催化硝酸鹽還原為亞*鹽,NO3ˉ +NADH+H+→NO2ˉ+NAD++H2O。在酸性條件下,產(chǎn)生的NO2ˉ能夠參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物,這種紫紅色化合物在540 nm處有吸收峰,540 nm下吸光值的變化即可表示酶活。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、水浴鍋/培養(yǎng)箱、臺式離心機、1 mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
1、組織前處理:
(1) 取適量誘導(dǎo)液于燒杯中,將新鮮標(biāo)本洗凈,濾紙吸干,放入誘導(dǎo)液中(淹沒即可),避光浸泡2 h,取出樣本,濾紙吸干后,-20℃冷凍30 min,取出樣本,濾紙吸干。(根據(jù)需要進(jìn)行誘導(dǎo)處理,一般不需要誘導(dǎo)處理,預(yù)實驗結(jié)果沒有活性則需要進(jìn)行誘導(dǎo)處理)
(2) 按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(稱取約0.1 g樣本,加入1 mL提取液),冰浴研磨,8000g,4℃離心10 min,取上清置冰上待測。
2、細(xì)胞或細(xì)菌的前處理:
先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi),棄上清,按照每500萬細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次)。8000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長至540 nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定:
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣本 | 100 | 100 | - | - |
0.1 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液 | - | - | 100 | - |
蒸餾水 | - | 375 | - | 475 |
試劑一 | 375 | - | 375 | - |
試劑二 | 125 | 125 | 125 | 125 |
混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)反應(yīng)30 min | ||||
試劑三 | 250 | 250 | 250 | 250 |
試劑四 | 250 | 250 | 250 | 250 |
混勻,室溫顯色20 min后測定540nm下的吸光度,分別記為A測定、A對照、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白。 |
三、NR活性計算
(1)按樣本蛋白濃度計算:
酶活定義:每小時每mg組織蛋白催化產(chǎn)生1 μmol NO2-的量為1個NR活力單位。
NR活力(U/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)×(A測定-A對照)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)×V樣本÷(V樣本×Cpr)÷T×F
= 0.2×(A測定-A對照)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)÷Cpr×F
(2)按樣本質(zhì)量計算:
酶活定義:每小時每g組織催化產(chǎn)生1 μmol NO2-的量為1個NR活力單位。
NR活力(U/g 質(zhì)量)=C標(biāo)準(zhǔn)×(A測定-A對照)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)×V樣本÷(W×V樣本÷V提?。?/span>÷T×F
= 0.2×(A測定-A對照)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)÷W×F
(3)按細(xì)胞數(shù)量計算:
酶活定義:每小時每1萬個細(xì)胞或細(xì)菌催化產(chǎn)生1 μmol NO2-的量為1個NR活力單位。
NR活力(U/104 cell)
=C標(biāo)準(zhǔn)×(A測定-A對照)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)×V樣本÷(細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×V樣本÷V提?。?/span>÷T×F
=0.2×(A測定-A對照)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)÷細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量×F
C標(biāo)準(zhǔn):亞硝 *標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,0.1 μmol/mL;V提?。杭尤胩崛∫后w積,1 mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,0.5 h;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;V樣本:加入的樣本體積,0.1 mL;細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量:以萬計;F:樣本稀釋倍數(shù)。
注意事項:
1. 吸光度大于0.8時,建議用提取液稀釋樣本,注意計算公式中參與計算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。
2. 嚴(yán)格按照樣本測定表格列出順序加入試劑進(jìn)行實驗。
實驗實例:
1. 取0.1 g綠蘿葉片加入1 mL提取液進(jìn)行勻漿研磨,離心取上清按照測定步驟操作,測得A測定=0.072、A對照=0.051、A標(biāo)準(zhǔn)=0.363、A空白=0.005,按樣本質(zhì)量計算酶活得:
NR活力(U/g 質(zhì)量)= 0.2×(A測定-A對照)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)÷W= 0.117 U/g 質(zhì)量。
2. 取0.1 g洋桔梗葉片加入1 mL提取液進(jìn)行勻漿研磨,離心取上清按照測定步驟操作,測得A測定=0.063、A對照=0.032、A標(biāo)準(zhǔn)=0.363、A空白=0.005,按樣本質(zhì)量計算酶活得:
NR活力(U/g 質(zhì)量)= 0.2×(A測定-A對照)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)÷W= 0.173 U/g 質(zhì)量。
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