品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
分子量 | 詳詢 | 貨號(hào) | BC5495 |
規(guī)格 | 100T/48S | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 蘋果酸含量檢測(cè) | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
蘋果酸含量檢測(cè)試劑盒(WST顯色法)說(shuō)明書
微量法
注意:本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào):BC5495
規(guī)格:100T/48S
產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體8 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體8mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體20μL×1支 | |
試劑四稀釋液 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1. 試劑二:臨用前加入5 mL 蒸餾水混勻,可分裝后-20℃保存,避免反復(fù)凍融,-20℃保存4周;
2. 試劑四:臨用前按試劑四:試劑四稀釋液=10μL:1mL(約40T)的比例稀釋試劑四備用,現(xiàn)用現(xiàn)配,用多少配多少;
3. 標(biāo)準(zhǔn)品:100μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取10μL 100μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液,加入240μL蒸餾水,充分混勻,配制成4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液;再取100μL 4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液,加入900μL蒸餾水,充分混勻,配制成0.4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液使用,現(xiàn)配現(xiàn)用。(實(shí)驗(yàn)中每管需要20μL,為減小實(shí)驗(yàn)誤差,故配制大體積)。
產(chǎn)品說(shuō)明:
L-蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,也是蘋果酸 - 天冬氨酸穿梭的重要組成部分。 蘋果酸-天冬氨酸穿梭是氧化磷酸化的還原當(dāng)量跨線粒體膜運(yùn)輸過(guò)程所必需的。在低等生物體內(nèi),蘋果酸在蘋果乳酸發(fā)酵的過(guò)程中轉(zhuǎn)化為乳酸,同時(shí)產(chǎn)生CO2。蘋果酸常用作食品和制藥工業(yè)的添加劑,蘋果酸的定量分析在啤酒、葡萄酒、奶酪和水果生產(chǎn)領(lǐng)域也具有至關(guān)重要的作用。
蘋果酸脫氫酶催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸、NADH和NH4+,在1-mPMS作用下,WST-1可與NADH 反應(yīng),產(chǎn)生水溶性Formazan,在450nm下有最大吸收峰,據(jù)此可計(jì)算蘋果酸含量。
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品:
分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水
浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
組織:按照質(zhì)量(g):提取液一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液一)加入提取液一,冰浴勻漿后于4℃,12000g離心10min,取0.8mL上清液,再緩慢加入0.15mL提取液二,緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生,4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。
細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(106個(gè)):提取液一體積(mL)為5~10:1的比例(建議5百萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);于4℃,12000g離心10min,取0.8mL上清液,再緩慢加入0.15mL提取液二,緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生,4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。
血清(漿)等液體:取100μL液體加入1mL提取液一,4℃ 12000g離心10min,取0.8mL上清液,再緩慢加入0.15mL提取液二,緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生,12000g離心10min后取上清待測(cè)。
注:提取液二需緩慢加入,加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡,建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。
二、測(cè)定步驟
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,波長(zhǎng)調(diào)至450nm,分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。
2. 加樣表:(按順序?qū)⑾铝性噭┘釉?/span>96孔板/1.5mL EP管中)
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣本 | 20 | 20 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)品 | - | - | 20 | - |
蒸餾水 | - | - | - | 20 |
試劑一 | 55 | 80 | 55 | 55 |
試劑二 | 40 | 40 | 40 | 40 |
試劑三 | 60 | 60 | 60 | 60 |
試劑四 | 25 | - | 25 | 25 |
充分混勻,于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱準(zhǔn)確避光反應(yīng)30min,于450nm處測(cè)定吸光值,分別記為A測(cè)定,A對(duì)照,A標(biāo)準(zhǔn),A空白,計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照;ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)置一個(gè)對(duì)照管,空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定1-2次。 |
三、蘋果酸含量的計(jì)算
1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
蘋果酸含量(μmol/mg prot)= ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣本÷(V樣本×Cpr)×F
= 0.4×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
蘋果酸含量(μmol/g 質(zhì)量)= ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)× (V上清+V提取液二) ÷ (W×V上清÷V提取液一) × F
= 0.475×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
蘋果酸含量(μmol/106 cell)= ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)× (V上清+V提取液二) ÷ (N×V上清÷V提取液一) ×F
= 0.475×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F
4. 按照液體體積計(jì)算
蘋果酸含量(μmol/mL)
= ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)× (V上清+V提取液二) ÷ [V液體×V上清÷ (V提取液一+V液體)] ×F
= 5.225×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F
C 標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.4μmol/mL;V樣本:加入的樣本體積,0.02mL;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,蛋白濃度需自行測(cè)定;V上清:提取時(shí)上清液體積,0.8mL;V提取液二:加入提取液二的體積,0.15mL;V提取液一:加入的提取液一體積,1mL;N:細(xì)胞數(shù)量,106個(gè);V液體:液體樣本體積,0.1mL;F:稀釋倍數(shù)。
注意事項(xiàng):
1. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑,因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。如需測(cè)定蛋白含量,需另取組織。
2. ΔA測(cè)定的測(cè)定范圍在0.01-1之間。如果測(cè)定吸光值超過(guò)線性范圍吸光值,可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測(cè)定,如果測(cè)定吸光值小于線性范圍吸光值,需要增加樣本量后再次測(cè)定,注意同步計(jì)算公式。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例:
1. 取0.1075g香蕉果肉加入1mL提取液一,冰浴勻漿后離心,取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,離心取上清后用蒸餾水稀釋8倍后按照測(cè)定步驟操作,使用96孔板測(cè)得計(jì)算,ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.581-0.098= 0.483,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.409-0.101=0.308,按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得:
蘋果酸含量(μmol/g 質(zhì)量)= 0.475×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.475×0.483÷0.308÷0.1075×8=55.43 μmol/g質(zhì)量。
2. 取0.1033g鼠肝加入1mL提取液一,冰浴勻漿后離心,取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,離心取上清后按照測(cè)定步驟操作,使用96孔板測(cè)得計(jì)算,ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.271-0.118=0.153,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.409-0.101=0.308,按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得:
蘋果酸含量(μmol/g 質(zhì)量)= 0.475×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.475×0.153÷0.308÷0.1033×1=2.28 μmol/g質(zhì)量。
相關(guān)系列產(chǎn)品:
BC0710/BC0715 α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性檢測(cè)試劑盒
BC0950/BC0955 琥珀酸脫氫酶(SDH)活性檢測(cè)試劑盒
BC0380/BC0385 丙 酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測(cè)試劑盒
BC1060/BC1065 檸檬酸合酶(CS)活性檢測(cè)試劑盒
BC2200/BC2205 丙 酮 酸(PA)含量檢測(cè)試劑盒
蘋果酸含量檢測(cè)試劑盒 微量法蘋果酸含量檢測(cè)試劑盒 微量法