土壤丙酮酸（S-PA）含量檢測(cè)試劑盒（酶法）說明書

                                               可見分光光度法

貨號(hào)：BC5530

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入3.6mL蒸餾水充分溶解，分裝保存，-20℃可以保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑三：臨用前按試劑三：蒸餾水=10μL：1mL（共1.01mL，約13T）的比例進(jìn)行稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：20μmol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

丙酮酸通過乙酰CoA連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。

在pH=7.5時(shí)，丙酮酸在LDH的催化作用下與NADH反應(yīng)，生成NAD ⁺和乳酸。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性Formazan。通過檢測(cè)450nm條件下吸光值，可以計(jì)算出丙酮酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、研缽、超聲清洗儀、30-50目篩和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

新鮮土樣自然風(fēng)干或37℃烘箱風(fēng)干，過30~50目篩。

稱取風(fēng)干混勻土樣約0.1g，加入1mL蒸餾水混勻；然后置于超聲清洗儀常溫超聲30min。然后12000g，常溫離心10min，取上清液待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一37℃預(yù)熱20min以上。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將20μmol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋得到0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

5、 操作表：(在1.5mLEP管中加入下列試劑)

三、土壤丙酮酸含量計(jì)算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}（y，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA_測(cè)定代入方程得到x（μmol/mL）。

2、土壤丙酮酸含量計(jì)算：

土壤丙酮酸含量（μmol/g 質(zhì)量）= x×V樣÷(V樣÷V提×W) = x÷W

V樣：加入的樣本體積，0.1mL；V提：前處理中加入蒸餾水的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

1. 如果測(cè)定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用蒸餾水稀釋樣本后再進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取約0.103g花盆土，加入1mL蒸餾水，超聲破碎30min，10000g，常溫離心10min，取上清待測(cè)。之后按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA_測(cè)定= A_空白-（A_測(cè)定-A_對(duì)照）=0.843-（0.493-0.028）=0.378，標(biāo)曲y=1.4576x-0.0002，R²=0.9924，x=0.2595µmol/mL, 計(jì)算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 質(zhì)量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =2.5191µmol/g 質(zhì)量。

2、 稱取約0.101g污泥，加入1mL蒸餾水，超聲破碎30min，10000g，常溫離心10min，取上清待測(cè)。之后按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA_測(cè)定= A_空白-（A_測(cè)定-A_對(duì)照）=0.843-（0.528-0.135）=0.450，標(biāo)曲y=1.4576x-0.0002，R²=0.9924，x=0.3089µmol/mL, 計(jì)算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 質(zhì)量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =3.0581µmol/g 質(zhì)量。

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