組胺含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5670

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前一支試劑二加入65μL蒸餾水溶解，2-8℃可保存4周。

2. 試劑二工作液的配制：根據(jù)樣本量按照試劑二：試劑二稀釋液=10μL：300μL（共310μL，約3S）的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)液。

4. 0.1875μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取75μL10μmol/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)液，加入925mL蒸餾水，混勻配制成0.75μmol/mL的組胺標(biāo)準(zhǔn)品；再吸取250μL 0.75μmol/mL組胺和750 μL蒸餾水混合配制成0.1875μmol/mL的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說明：

組胺（Histamine）是一種有潛在危害的含氮低分子量有機(jī)化合物，是由組*在脫羧酶的作用下產(chǎn)生的。當(dāng)組織受到損傷或發(fā)生炎癥和過敏反應(yīng)時，都可釋放組胺。組胺廣泛存在于各種食品中，攝入過量的組胺會對人體產(chǎn)生危害。組胺會被組胺脫氫酶（HDH）特異性分解，在1-mPMS作用下，電子轉(zhuǎn)移通過WST顯色，在470nm下有最大吸收峰，據(jù)此可以計算組胺含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機(jī)、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1：2.5~5的比例（建議稱取約0.2g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后，于60℃水浴30min，冷卻至室溫后于4℃ 10000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測。

2. 紅酒等（酚類含量高）液體：稱取粉劑一0.05g，加入500μL液體樣本和500μL提取液一，冰浴勻漿后，于60℃水浴30min，冷卻至室溫后于4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 10000g離心10min后取上清待測。

注：1、提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

2、樣本提取后盡可能在2小時內(nèi)測定結(jié)束，若樣本量過多建議分批次處理。

3、含酚類高的樣本，前處理時加入粉劑一約0.05g，與樣本一起冰浴勻漿。如紅酒，前處理時取500μL液體樣本加入500μL提取液一，和粉劑一約0.05g（無需準(zhǔn)確稱量），之后按照液體樣本繼續(xù)進(jìn)行冰浴勻漿后等后續(xù)處理。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至470nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一37℃預(yù)熱15min。

3、 操作表：（在1.5mLEP管中依次加入以下試劑）

三、組胺含量的計算

1. 按照蛋白濃度計算

組胺含量（μmol/mg prot）=ΔA測定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F

=0.1875×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×Cpr×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1875μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；F：稀釋倍數(shù)。

2. 按照樣本質(zhì)量計算

組胺含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×F =0.223×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×FC標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1875μmol/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；F：稀釋倍數(shù)。

3. 按照液體體積計算

組胺含量（μmol/mL）

=ΔA測定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）] ×F

=0.445×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.1875μmol/mL；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，0.5mL；V液體：液體樣本體積，0.5mL；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。

2. 如果樣本測定吸光值小于0.05或接近空白管吸光值，可適當(dāng)增大樣本量，空白管和標(biāo)準(zhǔn)管也需要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，注意同步修改計算公式。

3. ΔA測定大于1或者A測定大于1.5時，可用整理水稀釋樣本進(jìn)行測定。

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