品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
分子量 | 詳詢 | 貨號(hào) | BC5865 |
規(guī)格 | 100T/48S | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 甲基檸檬酸合酶活性檢測(cè) | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
甲基檸檬酸合酶(MCS)活性檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
貨號(hào):BC5865
規(guī)格:100T/48S
產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體0.6mL×1支 | -20℃保存 |
試劑二 | 液體20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制:
1、 試劑四:臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解,未用完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。
2、 試劑五:臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解,未用完的試劑-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。
產(chǎn)品說明:
甲基檸檬酸合酶(metheyl-citrate synthase,MCS)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,與檸檬酸合酶(CS)共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。
MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰*A,進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸;該反應(yīng)促使DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,在412nm處有特征吸收峰,據(jù)此可以計(jì)算MCS活性。
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)和10μL試劑一,進(jìn)行冰浴勻漿。12000g,4℃離心 10min,取上清置于冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌/細(xì)胞:按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(106個(gè)):提取液體積(mL)為5~10:1的比例(建議5百萬細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液和10μL試劑一),冰浴超聲波破碎(功率200W,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間5min);然后12000 g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟
1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm,分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。
2、 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱15min。
3、 操作表:在微量比色皿/96孔板中依次加入(適用于測(cè)定動(dòng)物組織樣本)
試劑名稱(μL) | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
試劑二 | 186 | 160 |
試劑三 | 7 | 7 |
試劑四 | - | 8 |
樣本 | 7 | 7 |
試劑五 | - | 18 |
在微量比色皿/96孔板中分別加入上述試劑,充分混勻后記錄412nm下10s時(shí)的初始吸光度A1對(duì)照、A1測(cè)定,之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起置于37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min,迅速取出比色皿并擦干,412nm下記錄5min10s時(shí)的吸光度A2對(duì)照、A2測(cè)定,計(jì)算ΔA=(A2測(cè)定-A1測(cè)定)-(A2對(duì)照-A1對(duì)照)。 |
4、 操作表:在微量比色皿/96孔板中分別加入(適用于測(cè)定微生物及植物組織樣本)
試劑名稱(μL) | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
試劑二 | 153 | 127 |
試劑三 | 7 | 7 |
試劑四 | - | 8 |
樣本 | 40 | 40 |
試劑五 | - | 18 |
在微量比色皿/96孔板中分別加入上述試劑,充分混勻后記錄412nm下10s時(shí)的初始吸光度A1對(duì)照、A1測(cè)定,之后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起置于37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min,迅速取出比色皿并擦干,412nm下記錄30min10s時(shí)的吸光度A2對(duì)照、A2測(cè)定,計(jì)算ΔA=(A2測(cè)定-A1測(cè)定)-(A2對(duì)照-A1對(duì)照)。 |
三、甲基檸檬酸合酶(MCS)計(jì)算公式
1. 使用96孔板測(cè)定(動(dòng)物組織樣本):
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
酶活定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
MCS活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反÷(Cpr×V樣)÷T=700.28×ΔA÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算:
酶活定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
MCS活性(U/g 質(zhì)量)=ΔA÷(ε×d)×V反÷(W÷V提取×V樣)÷T=707.28×ΔA÷W
ε:TNB摩爾消光系數(shù),13.6×10-3mL/(nmol·cm);d:比色皿光徑,0.6cm;V反:反應(yīng)體系體積,0.2mL; V樣:反應(yīng)體系中加入的樣本體積,0.007mL;V提取:加入提取液及試劑一的體積,1.01mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5min;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
2. 使用96孔板測(cè)定(微生物及植物組織樣本):
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
酶活定義:每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
MCS活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反÷(Cpr×V樣)÷T=20.42×ΔA÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算:
酶活定義:每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
MCS活性(U/g 質(zhì)量)=ΔA÷(ε×d)×V反÷(W÷V提取×V樣)÷T=20.63×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌/細(xì)胞計(jì)算:
酶活定義:每106個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
MCS活性(U/106 cell)=ΔA÷(ε×d)×V反÷(N÷V提取×V樣)÷T = 20.63×ΔA÷N
ε:TNB摩爾消光系數(shù),13.6×10-3mL/(nmol·cm);d:比色皿光徑,0.6cm;V反:反應(yīng)體系體積,0.2mL; V樣:反應(yīng)體系中加入的樣本體積,0.040mL;V提取:加入提取液及試劑一的體積,1.01mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;N:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),以106計(jì)。
3. 使用微量比色皿測(cè)定:
將上述公式中的d=0.6cm改為d=1cm(微量比色皿光徑)進(jìn)行計(jì)算即可。
注意事項(xiàng):
1. 測(cè)定過程中樣本和所有試劑在冰上放置,以免變性和失活。
2. 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn),一個(gè)人比色,一個(gè)人計(jì)時(shí),以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3. 由于提取液含有蛋白成分(約1mg/mL),故測(cè)定蛋白濃度時(shí)需要同時(shí)測(cè)定提取液的蛋白濃度。
4. 當(dāng)樣本ΔA<0.01時(shí),可適當(dāng)延長(zhǎng)酶促反應(yīng)時(shí)間或增大樣本量后測(cè)定,注意同步修改計(jì)算公式。
5. 當(dāng)樣本ΔA>1或A>1.5時(shí),可將樣本用提取液適當(dāng)稀釋后測(cè)定,注意同步修改計(jì)算公式。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例:
1、 取0.0918g小鼠心臟加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿,取上清用后,按照測(cè)定步驟操作,用96孔板測(cè)得ΔA=(A2測(cè)定-A1測(cè)定)-(A2對(duì)照-A1對(duì)照)=(0.665-0.349)-(0.261-0.251)=0.306,按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得:
MCS活性(U/g 質(zhì)量)= 707.28×ΔA÷W =2357.60 U/g 質(zhì)量。
2、 取0.1186g霉菌加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿,取上清后按照測(cè)定步驟操作,用96孔板測(cè)得ΔA=(A2測(cè)定-A1測(cè)定)-(A2對(duì)照-A1對(duì)照)=(0.362-0.262)-(0.255-0.261)=0.106,按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得:
MCS活性(U/g 質(zhì)量)= 20.63×ΔA÷W =18.72 U/g 質(zhì)量。
3、 取0.1013g竹葉加入1mL提取液和10μL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿,取上清后按照測(cè)定步驟操作,用96孔板測(cè)得ΔA=(A2測(cè)定-A1測(cè)定)-(A2對(duì)照-A1對(duì)照)=(0.291-0.252)-(0.261-0.249)=0.027,按樣本質(zhì)量計(jì)算MCS活性得:
MCS活性(U/g 質(zhì)量)=20.63×ΔA÷W =5.50 U/g 質(zhì)量。
參考文獻(xiàn):
[1] Maerker, C, et al. "Methylcitrate synthase from Aspergillus fumigatus. Propionyl-CoA affects polyketide synthesis, growth and morphology of conidia. " Febs Journal 272.14(2010):3615-3630.
[2] Watson, D., Lindel, D.L. & Fall, R. Pseudomonas aeruginosa contains an inducible methylcitrate synthase. Current Microbiology 8, 17–21 (1983).
相關(guān)系列產(chǎn)品:
BC0380/BC0385 丙酮酸脫氫酶(PDH)活性檢測(cè)試劑盒
BC1060/BC1065 檸檬酸合酶(CS)活性檢測(cè)試劑盒
BC6020/BC6025 乙酰輔*A羧化酶(ACC)活性檢測(cè)試劑盒(酶法)
甲基檸檬酸合酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法 甲基檸檬酸合酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法