蛋白質總巰基含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5800

規(guī)格：50T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液配制：臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，請勿一次性全部混合。

2、 若試劑二有析出，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。

3、 標準品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）。臨用前加入1.3mL蒸餾水配制成25μmol/mL，2-8℃保存4周。

4、 0.125μmol/mL標準品配制：取50μL 25μmol/mL標準品，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成1.25μmol/mL的標準品；然后取100μL 1.25μmol/mL標準品，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.125μmol/mL的標準品使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產品說明：

巰基的存在使得蛋白質能夠進行二硫鍵的形成，從而維持分子的穩(wěn)定性和功能性。巰基還參與到氧化還原反應中，具有重要的生物學作用。在細胞內，巰基含量的變化與多種疾病的發(fā)生和進展密切相關，因此巰基也成為了生物醫(yī)學領域中的重要研究對象。本試劑盒測定的是蛋白質二硫鍵斷裂產生的巰基和本身游離巰基的總和。

還原劑會使二硫鍵裂解生成巰基，巰基會發(fā)生親核反應，即巰基與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰，據(jù)此可以計算蛋白質總巰基含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、低溫離心機、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、丙酮（AR）、蒸餾水。

操作步驟

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進行實驗,；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

2. 細菌/細胞：按照細菌/細胞數(shù)量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌/細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，總時間3min）后，于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進行實驗；（2）加入試劑一后會有大量氣泡產生，請緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

3. 血清/血漿、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙酮，4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進行實驗。（注：若測定數(shù)值偏小，可改變樣本與丙酮的比例，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮，注意同步修改計算公式）。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至412nm。蒸餾水調零。

2、 操作表：（建議在5mL的EP管中操作）

三、蛋白質總巰基含量的計算

1. 按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質總巰基含量（μmol/mg prot）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F

=0.125× ΔA測定÷ΔA標準×Cpr×F

2. 按照樣本質量計算

蛋白質總巰基含量（μmol/g 質量）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷W×F

=0.25×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F

3. 按照液體體積計算

蛋白質總巰基含量（μmol/mL）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷V液樣×F =2.5×ΔA測定÷ΔA標準×F

4. 按照細胞/細菌數(shù)量計算：

蛋白質總巰基含量（μmol/10⁶ cell）=ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V試劑一÷N÷2×F=0.25×ΔA測定÷ΔA標準÷N×F

C標準：標準管濃度，0.125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.3mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定，推薦使用BCA方法測定；W：樣本質量，g；V試劑一：提取時加入試劑一體積，2mL；V液樣：提取時加入的樣本體積，0.1mL；F：稀釋倍數(shù)；N：細胞/細菌總數(shù)，以10⁶計。

注意事項：

1. 若樣本ΔA測定<0.01，可適當增大樣本量后測定，注意同步修改空白管和標準管及計算公式；若樣本ΔA測定>1.5，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測定，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1、 取100μL馬血清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.557-0.038=0.519，ΔA標準=A標準-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質量計算蛋白質總巰基含量得：

蛋白質總巰基含量（μmol/mL）= 2.5×ΔA測定÷ΔA標準=2.329μmol/mL。

2、 取0.1036g鼠肝，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=0.727-0.111=0.616，ΔA標準=A標準-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質量計算蛋白質總巰基含量得：

蛋白質總巰基含量（μmol/g 質量）= 0.25×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =2.669μmol/g 質量。

3、 取0.1078g黃豆粉，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得ΔA測定=A測定-A對照=1.080-0.068=1.012，ΔA標準=A標準-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質量計算蛋白質總巰基含量得：

蛋白質總巰基含量（μmol/g 質量）=0.25×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =8.427μmol/g 質量。

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