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  • 蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測試劑盒 微量法
產(chǎn)品名稱:

蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測試劑盒 微量法

產(chǎn)品品牌: SOLARBIO/索萊寶 價格:
廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品時間: 2024-04-23
有效期
6個月
儲存條件
2-8℃
中文名稱
蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測試劑盒 微量法
單位

英文名稱
Protein Disulfide Bond Content Assay Kit
檢測方法
微量法
規(guī)格
100T/48S
自備試劑
該試劑盒實驗過程中需自備試劑,詳情見網(wǎng)站說明書

產(chǎn)品概述

品牌SOLARBIO/索萊寶CAS詳詢
分子式詳詢純度詳詢
分子量詳詢貨號BC5795
規(guī)格100T/48S供貨周期現(xiàn)貨
主要用途蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測應用領域環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合

蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測試劑盒說明書

微量法

貨號:BC5795

規(guī)格:100T/48S

產(chǎn)品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

試劑名稱

規(guī)格

保存條件

提取液一

液體40 mL×1

2-8℃保存

提取液二

液體40 mL×1

2-8℃保存

試劑一

液體120 mL×1

2-8℃保存

試劑二

液體20 mL×1

2-8℃保存

試劑三

液體6 mL×1

2-8℃保存

試劑四

液體1.2 mL×1

2-8℃保存

粉劑一

粉劑×1

2-8℃保存

標準品

粉劑×1

2-8℃保存

溶液的配制:

1、 提取液配制:臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一:提取液二=1mL1 mL進行配制,勿一次性全部混合。

2、 若試劑二有析出,可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。

3、 標準品:10mg還原型谷*甘肽(GSH)。臨用前加入1.3mL蒸餾水配25μmol/mL,2-8℃保存4。

4、 0.125μmol/mL標準品配制:取50μL 25μmol/mL標準品,加入950μL蒸餾水,充分混勻,配制成1.25μmol/mL的標準品;然后取100μL 1.25μmol/mL標準品,加入900μL蒸餾水,充分混勻,配制成0.125μmol/mL的標準品使用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明:

蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子,存在于一切生物體內(nèi),是生命的基礎物質(zhì)。二硫鍵是連接不同肽鏈或同一肽鏈中,兩個不同半胱氨*殘基的巰基的化學鍵。二硫鍵對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響很大,在蛋白質(zhì)分子中,起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用,所以測定蛋白質(zhì)二硫鍵含量尤為重要。

還原劑會使二硫鍵裂解,裂解后的巰基會發(fā)生親核反應,即巰基與5,5’-二硫代--硝基苯甲酸(DTNB)反應,生成黃色化合物,在412nm處有最大吸收峰,據(jù)此可以計算蛋白質(zhì)二硫鍵含量。


注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機、研缽/勻漿器、丙酮(AR)、蒸餾水。

操作步驟

 

一、樣本處理(可適當調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)

1. 組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,3000rpm 離心10min,棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一,攪勻后溶解沉淀,沉淀溶解液作為樣本進行實驗。(注:(1)植物葉片等纖維含量較高的樣本,溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min,取上清作為樣本進行實驗,;(2)加入試劑一后會有大量氣泡產(chǎn)生,請緩慢加入,建議使用5mLEP)。

2. 細菌/細胞:按照細菌/細胞數(shù)量(106個):提取液體積(mL)為5~101的比例(建議5百萬細菌/細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎(功率200W,超聲3秒,間隔10秒,總時間3min,4℃,3000rpm 離心10min,棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一,攪勻后溶解沉淀,沉淀溶解液作為樣本進行實驗。注:1若沉淀溶解不全,可4℃ 3000rpm離心3min,取上清作為樣本進行實驗;(2)加入試劑一后會有大量氣泡產(chǎn)生,請緩慢加入,建議使用5mLEP

3. 血清/血漿、牛奶等液體:100μL液體樣本加入0.9mL丙酮,4℃,3000rpm 離心10min,棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一,攪勻后溶解沉淀,沉淀溶解液作為樣本進行實驗。(注:若測定數(shù)值偏小,可改變樣本與丙酮的比例,如0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮,注意同步修改計算公式)。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至412nm,分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表:(建議在2mLEP管中操作

試劑名稱(mL

對照管

測定管

空白管

標準管


樣本

0.3

0.3

-

-


蒸餾水

-

-

0.3

-


標準品

-

-

-

0.3


粉劑一

-

3mg

-

-


開蓋反應30min,期間每隔10min用吸頭吹打至氣泡不再產(chǎn)生,禁止扣蓋反應

-

-


提取液

0.18

0.18

0.18

0.18


緩慢加入提取液混勻,并用吸頭反復吹打至氣泡不再產(chǎn)生(期間會有大量氣泡產(chǎn)生,開蓋放置)


試劑二

0.18

0.18

0.18

0.18


充分混勻,4℃ 3000rpm離心10min后取上清于1.5mL EP/96孔板中

-

-

上清液

0.14

0.14

0.14

0.14


試劑三

0.05

0.05

0.05

0.05


充分混勻,測定412nm下的吸光度,分別記為A1對照、A1測定。

-

-


試劑四

0.01

0.01

0.01

0.01


充分混勻,室溫靜置10min后測定412nm下的吸光度,分別記為A2對照、A2測定、A空白、A標準。計算ΔA測定=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照),ΔA標準=A標準-A空白??瞻坠芎蜆藴使苤恍铚y1-2次。每個測定管需設一個對照管。

注:第一步測定412nm吸光度時,可將反應液全部倒入96孔板中/微量玻璃比色皿中測定,之后可直接在96孔板中/微量玻璃比色皿中加入試劑四混勻后繼續(xù)測定。


三、蛋白質(zhì)二硫鍵含量的計算

 

 

 

1. 按照樣本蛋白濃度計算:

蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/mg prot=ΔA測定÷ΔA標準÷C標準)×V樣本÷V樣本×Cpr÷2×F

=0.0625× ΔA測定÷ΔA標準×Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計算:

蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/g 質(zhì)量)=ΔA測定÷ΔA標準÷C標準)×V試劑一÷W÷2×F

=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F

3. 按照液體體積計算:

蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/mL=ΔA測定÷ΔA標準÷C標準)×V試劑一÷V液樣÷2×F

=1.25×ΔA測定÷ΔA標準×F

4. 按照細胞/細菌數(shù)量計算:

蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol /106 cell=ΔA測定÷ΔA標準÷C標準)×V試劑一÷N÷2×F
=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷N×F

C標準:標準管濃度,0.125μmol/mLV樣本:加入的樣本體積,0.3mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,蛋白濃度需自行測定,可以使用BCA方法測定;W:樣本質(zhì)量,g;V試劑一:提取時加入試劑一體積,2mL;V液樣:提取時加入的樣本體積,0.1mL;2:一個二硫鍵裂解產(chǎn)生兩個巰基;F:稀釋倍數(shù);N:細胞/細菌總數(shù),以106。

注意事項:

1. 若樣本Δ測定A<0.01,可適當增大樣本量后測定,注意同步修改空白管和標準管及計算公式;若樣本ΔA測定>1.5可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測定,注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。

實驗實例:

1、 100μL馬血清,按照測定步驟操作,用96孔板測得ΔA測定=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照)=0.348-0.113-0.047-0.045=0.233,ΔA標準=A標準-A空白=0.417-0.105=0.312,按樣本液體體積計算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得:

蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/mL= 1.25×ΔA測定÷ΔA標準×F =0.933μmol/mL

2、 0.1036g鼠肝,按照測定步驟操作,用96孔板測得ΔA測定=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照)=0.475-0.107-0.261-0.105=0.212,ΔA標準=A標準-A空白=0.417-0.105=0.312,按樣本質(zhì)量計算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得:

蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/g 質(zhì)量=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =0.820μmol/g 質(zhì)量。

3、 0.1078g黃豆粉,沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后,按照測定步驟操作,用96孔板測得ΔA測定=A2測定-A1測定)-A2對照-A1對照)=0.762-0.084-0.123-0.070=0.625,ΔA標準=A標準-A空白=0.417-0.105=0.312,按樣本質(zhì)量計算蛋白質(zhì)二硫鍵含量得:

蛋白質(zhì)二硫鍵含量(μmol/g 質(zhì)量=0.125×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =4.646μmol/g 質(zhì)量。

相關(guān)系列產(chǎn)品:

BC1370/BC1375  總巰基含量檢測試劑盒

BC1430/BC1435  非蛋白巰基含量檢測試劑盒

BC5800/BC5805  蛋白質(zhì)總巰基含量檢測試劑盒

BC5890/BC5895  蛋白質(zhì)游離巰基含量檢測試劑盒

蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測試劑盒 微量法 蛋白質(zhì)二硫鍵含量檢測試劑盒 微量法


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