尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDPGT）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

貨號(hào)：BC5810

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑五：臨用前加入1.238mL蒸餾水，-20℃分裝可保存4周，避免反復(fù)凍融；

2. 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑二：試劑三：試劑四=80μL：80μL：80μL（0.24mL，2T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL的對(duì)硝基 苯 *溶液。臨用前取50μL 5μmol/mL對(duì)硝基 苯 * 溶液，加入950μL蒸餾水，配制成0.25μmol/mL對(duì)硝基 苯 *溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（glucuronosyltransferase，UDPGT/UGT，EC 2.4.1.17）是一種結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白，該酶催化葡萄糖醛酸基團(tuán)從供體尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移至受體上，受體包括酚類(lèi)、醇類(lèi)、胺類(lèi)和脂肪酸類(lèi)。葡萄糖醛酸化代謝促進(jìn)了藥物和其他外源物質(zhì)通過(guò)腎臟或膽汁的排泄，在生物體內(nèi)代謝、解毒、清除過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

UDPGT催化供體尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至對(duì)硝基 苯 *，后者在405nm處有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值降低速率可計(jì)算UDPGT活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 稱取0.1g樣本，加入1.0 mL提取液，用勻漿器或研缽于冰上勻漿；

2. 4℃，800g離心10 min，棄沉淀，留上清液，4℃，9000 g離心20 min，棄沉淀，留上清液；

3. 4℃，12000g離心60 min，棄上清，留沉淀。沉淀中加入0.5 mL提取液重懸，置于冰上待測(cè)。

二、 測(cè)定步驟

1．可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm，蒸餾水調(diào)零；

2．將試劑一37℃預(yù)熱15min；

3．操作表（在EP管中加入下列試劑）：

三、UDPGT活性計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每min催化消耗1nmol對(duì)硝基 苯*定義為一個(gè)酶活單位。

UDPGT活性（U/mg prot）=（ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（Cpr×V樣）×10³÷T

=25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織每min催化消耗1nmol對(duì)硝基 苯*定義為一個(gè)酶活單位。

UDPGT活性（U/g 質(zhì)量）=（ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×10³÷T

=12.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)：0.25μmol/mL；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.2mL；V樣總：重懸沉淀加入提取液的體積，0.5mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；10³：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol=10³nmol；T：反應(yīng)時(shí)間，10min。

注意事項(xiàng)：

1. 如果?A測(cè)定小于0.004或測(cè)定管吸光值接近對(duì)照管，可以增加樣本量或者延長(zhǎng)37℃反應(yīng)時(shí)間后再進(jìn)行測(cè)定；如果?A測(cè)定大于0.9，建議將重懸液用提取液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1027g新鮮小鼠肝臟樣本，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，多次離心后加入0.5mL提取液重懸沉淀，按照測(cè)定步驟操作，用玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定=A對(duì)照-A測(cè)定=1.473-0.843=0.630，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.741- 0.005=0.736，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

UDPGT活性（U/g 質(zhì)量）=12.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =104.184 U/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] Visser TJ, Kaptein E, van Raaij JA. et al. Multiple UDP-glucuronyltransferases for the glucuronidation of thyroid hormone with preference for 3,3',5'-triiodothyronine (reverse T3) [J]. Federation of European Biochemical Societies Letters, 1993, 315(1): 65-68.

[2] Viollon-Abadie C, Lassere D, Debruyne E. et al. Phen obarbit al, beta-naphthoflavone, clofibrate, and pregnenolone- 16alpha-carbonitrile do not affect hepatic thyroid hormone UDP-glucuronosyl transferase activity, and thyroid gland function in mice [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1999, 155(1): 1-12.

[3] Nicod L, Rodriguez S, Letang JM. et al. Antioxidant status, lipid peroxidation, mixed function oxidase and UDP-glucuronyl transferase activities in livers from control and DOCA-salt hypertensive male Sprague Dawley rats [J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 2000, 203(1-2): 33-39.

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