α-淀*酶（α-AL）活性檢測試劑盒（碘-淀粉比色法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC4575

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入6.25 mL試劑三，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間不斷攪拌粉劑至溶解，用不完的試劑2-8℃保存8周；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg淀粉標(biāo)準(zhǔn)品。臨用前加10 mL試劑三，置沸水浴中振蕩溶解，配成1 mg/mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)液，2-8℃保存四周。

產(chǎn)品說明：

淀*酶負(fù)責(zé)水解淀粉，包括α-淀*酶和β-淀*酶。α-淀*酶(EC 3.2.1.1)可隨機(jī)地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。

α-淀*酶催化淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵水解，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖以及糊精等，碘可以與未被水解的淀粉結(jié)合，生成在570nm下有特征吸收峰的復(fù)合物，其深淺可計(jì)算出淀*酶的活力單位。α-AL耐熱，但是β-淀*酶可在70℃鈍化15min。因此粗酶液經(jīng)過70℃鈍化15min，就只有α-AL能夠催化淀粉水解。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀/可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：稱取約0.1g樣本，加1mL蒸餾水勻漿；勻漿后在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次，使其充分提??；6000g，室溫離心10min，吸取上清液即為淀*酶原液。

2、液體：直接檢測。（若有渾濁則離心后進(jìn)行測定）

二、測定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到570nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 將淀粉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

實(shí)驗(yàn)中每個標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3、 按操作表依次加入各試劑：

三、α-淀*酶活性計(jì)算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，mg/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，mg/mL）。

2、α-淀*酶活性計(jì)算

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活力單位。

α-淀*酶活性 (U/g 質(zhì)量)=x×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.1×x÷W

（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。

α-淀*酶活性 (U/mg prot)= x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.1×x÷Cpr

（3）按照液體體積計(jì)算

單位定義：每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。

α-淀*酶活性 (U/mL)= x×V樣÷V樣÷T=0.1×x

V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：樣本總體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，10min。

注意事項(xiàng)：

吸光值大于1.5或者ΔA大于0.8 時，可以對樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取約0.1g藜葉片，加1mL蒸餾水勻漿，勻漿后在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次，使其充分提取；6000g，室溫離心10min，吸取上清液，之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定=A空白-（A測定-A對照）=1.065-（0.849-0.220）=0.436，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.628x-0.0051，計(jì)算x=0.168，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

α-淀*酶活性 (U/g 質(zhì)量)=0.1×x÷W=0.168 U/g 質(zhì)量。

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