磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
紫外分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。
貨號(hào)：BC0530
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二A：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2. 試劑二B：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑二C：臨用前取一支加入0.25mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；

4. 試劑二D：臨用前加入1mL蒸餾水，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

5. 試劑三：臨用前根據(jù)用量按照試劑三:蒸餾水為2μL:13μL（約3T）的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；

6. 試劑四：臨用前根據(jù)用量按照試劑四:蒸餾水為4μL:65μL（約13T）的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；

7. 工作液的配制：根據(jù)樣本量按試劑一：試劑二A：試劑二B：試劑二C：試劑二D =22mL：0.5mL：0.5mL：0.25mL：0.5mL（約29T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

產(chǎn)品說(shuō)明：
磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase，PFK，EC 2.7.1.11）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，負(fù)責(zé)將果糖-6-磷酸和ATP轉(zhuǎn)化為果糖-1,6二磷酸和ADP，是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一。
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，*酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映PFK活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。


需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
“具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件"
注意事項(xiàng)：

1. 
   

1. 
   

2. 測(cè)定過(guò)程中試劑三、試劑四和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

3. 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

4. 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5. 若ΔA大于0.5，需將酶液用酶提取液稀釋，使ΔA小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。注意同步修改計(jì)算公式。

6. 
   

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g黑麥草加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA= A1-A2 = 1.375-0.995=0.380，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

PFK活性（U/g 質(zhì)量）=450×ΔA ÷W=450×0.380 ÷0.1=1710 U/g 質(zhì)量。

1. 取0.1g桃葉加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA= A1-A2 = 1.38-1.323=0.057，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

PFK活性（U/g 質(zhì)量）=450×ΔA ÷W=450×0.057 ÷0.1=256.5 U/g 質(zhì)量。
參考文獻(xiàn)：

1. Papagianni M, Avramidis N. Lactococcus lactis as a cell factory: a twofold increase in phosphofructokinase activity results in a proportional increase in specific rates of glucose uptake and lactate formation[J]. Enzyme and microbial technology, 2011, 49(2): 197-202.

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