品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
分子量 | 詳詢 | 貨號(hào) | BC4345 |
規(guī)格 | 100T/48S | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 亞鐵氧化酶(HP)活性檢測(cè) | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
亞鐵氧化酶(HP)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
貨號(hào):BC4345
規(guī)格:100T/48S
產(chǎn)品組成:使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、試劑三:臨用前加入6 mL蒸餾水溶解備用,用不完的試劑2-8℃保存4周。
2、標(biāo)準(zhǔn)品:9 µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液。
產(chǎn)品說(shuō)明:
亞鐵氧化酶(Hsphasetin,HP)是銅藍(lán)蛋白的同系物,催化亞鐵離子(Fe2+)氧化為三價(jià)鐵離子(Fe3+),從而三價(jià)鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合,參與細(xì)胞鐵釋放。
以一定濃度的Fe2+ 為底物,在亞鐵氧化酶的催化作用下Fe2+ 被氧化為Fe3+,Fe2+ 與菲咯嗪形成有色復(fù)合物,在562 nm處有特征吸收峰,先計(jì)算出未被氧化的Fe2+ 的含量,進(jìn)而得出被氧化的Fe2+ 的含量,可通過(guò)Fe2+被氧化的速率來(lái)反映亞鐵氧化酶活性。
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
1、組織:按照質(zhì)量(g)︰蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例(建議稱取約0.1 g,加入1 mL蒸餾水)加入蒸餾水,冰浴勻漿后于10000 rpm,4℃離心10 min,取上清置于冰上待測(cè)。
2、血清或血漿:建議用蒸餾水將血清或血漿稀釋2~4倍后直接檢測(cè)。若溶液渾濁則離心取上清置于冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至562 nm,分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。
2、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋:將9µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水倍比稀釋為360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表:
序號(hào) | 稀釋前濃度(nmol/mL) | 標(biāo)準(zhǔn)液體積(µL) | 蒸餾水體積(µL) | 稀釋后濃度(nmol/mL) |
1 | 9000 | 40 | 960 | 360 |
2 | 360 | 500 | 500 | 180 |
3 | 180 | 500 | 500 | 90 |
4 | 90 | 500 | 500 | 45 |
5 | 45 | 500 | 500 | 22.5 |
6 | 22.5 | 500 | 500 | 11.25 |
7 | 11.25 | 500 | 500 | 5.625 |
備注:實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需40µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4、 操作表:在1.5 mL離心管(分光光度計(jì))或96孔板中依次加入下列試劑:
試劑名稱 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 | 無(wú)基質(zhì)管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
蒸餾水(µL) | - | - | 8 | 8 | 8 |
樣本(µL) | 8 | 8 | - | - | - |
試劑一(µL) | 112 | 112 | 112 | 112 | 112 |
用移液槍充分吹打混勻 | |||||
試劑二(µL) | - | 40 | 40 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)溶液(µL) | - | - | - | - | 40 |
蒸餾水(µL) | 40 | - | - | 40 | - |
混勻,37℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確反應(yīng)3 min | |||||
試劑三(µL) | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
混勻,于微量玻璃比色皿/96孔板中測(cè)定562 nm處吸光值A,分別記為A對(duì)照管,A測(cè)定管、A無(wú)基質(zhì)管、A空白管和A標(biāo)準(zhǔn)管。計(jì)算ΔA測(cè)定=(A無(wú)基質(zhì)管-A空白管)-(A測(cè)定管-A對(duì)照管),ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管,同一批次無(wú)基質(zhì)管、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)1-2次。 |
三、亞鐵氧化酶活性計(jì)算
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:
以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(nmol/mL)為x軸,其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b,將ΔA測(cè)定帶入方程得到樣本濃度(x,nmol/mL)。
2、 亞鐵氧化酶活性的計(jì)算:
(1)按照樣本蛋白濃度計(jì)算
酶活定義:每mg蛋白每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個(gè)酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活(U/mg prot)= x×V試劑二÷(V樣×Cpr)÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義:每g樣品每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個(gè)酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活(U/g鮮重)= x×V試劑二÷(V樣×W÷V提?。?/span>÷T×N = 1.667x÷W×N
(3)按液體體積計(jì)算
酶活定義:每mL樣本每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個(gè)酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活(U/mL)= x×V試劑二÷V樣÷T×N = 1.667x×N
V試劑二:加入的試劑二體積,0.04 mL;V樣:加入的樣本體積,0.008 mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL,蛋白濃度自行測(cè)定;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間:3 min;N:稀釋倍數(shù)。
注意事項(xiàng):
1. 當(dāng)A測(cè)定低于0.1時(shí),建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例:
1、 取0.1g結(jié)腸,進(jìn)行樣本處理,按照測(cè)定操作步驟,測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定 =(A無(wú)基質(zhì)管-A空白管)-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)=(1.144-0.041)-(1.114-0.048)=0.037,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0031x - 0.0007,計(jì)算x=11.710,按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得:
亞鐵氧化酶酶活(U/g質(zhì)量)= 1.667×x÷W×N= 1.667×11.710÷0.1=195.161 U/g質(zhì)量。
2、 取兔血清,按照測(cè)定操作步驟,測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=(A無(wú)基質(zhì)管-A空白管)-(A測(cè)定管-A對(duì)照管)=(0.577-0.048)-(1.114-0.048)=0.574,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0031x - 0.0007,計(jì)算x=184.935,按照液體體積計(jì)算酶活得:
亞鐵氧化酶酶活(U/mL)= 1.667×x=1.667×184.935=308.287 U/mL
相關(guān)系列產(chǎn)品:
BC1300/BC1305 銅藍(lán)蛋白(Cp)活性檢測(cè)試劑盒
BC1310/BC1315 總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒
BC4430/BC4435 尿酸酶活性檢測(cè)試劑盒
BC1360/BC1365 尿酸(UA)含量檢測(cè)試劑盒
BC1320/BC1325 羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒
亞鐵氧化酶(HP)活性檢測(cè)試劑盒 微量法 亞鐵氧化酶(HP)活性檢測(cè)試劑盒 微量法