N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶（NAG）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC4295

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支加入1 mL蒸餾水溶解備用；可-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：5 μmol/mL*溶液。

產(chǎn)品說明：

N-乙酰-β-D -葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.52，N-acetyl-β-D-glucosidase，NAG）廣泛分布于各種組織中，是一種細胞內(nèi)溶體酶，測定NAG活性可用于腎小管間質(zhì)性腎炎、尿路感染、糖尿病腎病綜合癥、高血壓腎病、腎移植后的排異反應(yīng)和腎病綜合癥的早期診斷。

NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成對-*酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定400nm下吸光度的變化來計算NAG活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

,苯* 溶液,*可見分光光度計/酶標(biāo)儀、天平、臺式離心機、超聲破碎儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）:提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取0.1g 組織，加入1mL 提取液），冰浴勻漿。15000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、細菌、細胞：先收集細胞或細菌樣本到離心管內(nèi)，離心棄上清后，按照細胞數(shù)量10⁴個：提取液體積（ml）500~1000:1 的比例，建議500萬細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細胞（冰浴，功率200w，超聲3 s，間隔7s，總時間3min），然后15000g，4℃，離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）等液體：直接測定。

,苯* 溶液,*

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：取125μL 5 μmol/mL*溶液，加入875μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.625 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實驗中每管需要10μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

3、 操作表 (在1.5mL離心管中依次加入下列試劑) ：

    混勻后室溫放置2min，吸取200μL于微量玻璃比色皿或者96孔板中測定400nm的吸光度，分別記為A測定管、A對照管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管。計算ΔA測定=A測定管-A對照管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個測定管需設(shè)一個對照管。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需測1-2次。

三、NAG活性計算

1、按蛋白濃度計算

活力單位定義：每mg蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol*定義為一個酶活力單位。

NAG (U/mg prot) =ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V樣÷（Cpr×V樣）÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

活力單位定義：每g樣本在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol*定義為一個酶活力單位。

NAG (U/g 質(zhì)量)= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V樣÷(V樣÷V樣總×W)÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

3、按細胞數(shù)量計算

活力單位定義：每10⁴個細胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol*定義為一個酶活力單位。

NAG (U/10⁴ cell)= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V樣÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

=20.83×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷細胞數(shù)量

4、按液體體積計算

活力單位定義：每毫升液體在反應(yīng)體系中每分鐘催化生成1nmol*為一個酶活力單位。

NAG (U/mL)= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V樣÷V樣÷T=20.83×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度：0.625μmol/mL；V樣總：提取液體積，1mL；V樣：加入的樣本體積，0.01mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時間，30min；細胞數(shù)量：以萬計；W：樣本質(zhì)量，g；1000：換算系數(shù)，1μmol=1000nmol。

注意事項：

吸光度若大于1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后進行測定。

實驗實例：

1. 稱取0.1g大鼠脾臟組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。15000g，4℃離心10min，取上清稀釋5倍，按照測定步驟操作，使用96孔板測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.582-0.067=0.515，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.268-0.047=0.221，按樣本質(zhì)量計算得：

NAG（U/g 質(zhì)量）=20.83×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×5（稀釋倍數(shù)）=2427.02 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1g玉蘭，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。15000g，4℃離心10min，取上清，按照測定步驟操作，使用96孔板測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.405-0.112=0.293，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.268-0.047=0.221，按樣本質(zhì)量計算得：

NAG（U/g 質(zhì)量）=20.83×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=276.162 U/g 質(zhì)量。

3. 取兔血清直接檢測，按照測定步驟操作，使用96孔板測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.368-0.246=0.122，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.268-0.047=0.221，按液體體積計算得：

NAG（U/mL）=20.83×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=11.4989 U/mL。

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