品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC2445 |
規(guī)格 | 100T/48S | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 測定意義:脂蛋白酯酶是脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì) | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
脂蛋白酯酶(LPL)活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意:本產(chǎn)品試劑有所變動,請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號:BC2445
規(guī)格:100T/48S
產(chǎn)品組成:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體80 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1. 試劑二:臨用前加入1mL丙酮溶解備用,用不完的試劑-20℃保存4周。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品:5 μmol/mL對硝基苯*標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前取30μL 5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液,加入450μL試劑一,充分混勻,配制成0.3125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用,現(xiàn)用現(xiàn)配(實(shí)驗(yàn)中每管需要30μL,為減小實(shí)驗(yàn)誤差,故配制大體積)。
產(chǎn)品說明:
脂蛋白酯酶(Lipoproteinlipase,LPL)是甘油三酯降解的降速酶,可催化甘油三酯水解為脂肪酸和單酸甘油酯,主要在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中合成,在脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。
脂蛋白酯酶水解4-硝基苯棕櫚酸酯產(chǎn)生4-硝基苯*,在400nm有特征吸收峰。
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫臺式離心機(jī)、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、EP管、冰、丙酮和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣本:直接檢測。
二、測定步驟
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至400nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 操作表:在1.5mL EP管中進(jìn)行下列操作:
樣本名稱 | 對照管 | 測定管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣本(μL) | 30 | 30 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)管(μL) | - | - | 30 | - |
蒸餾水(μL) | - | - | - | 30 |
試劑一(μL) | 120 | 108 | 120 | 120 |
試劑二(μL) | - | 12 | - | - |
混勻,45℃水浴10min | - | - | ||
試劑三(μL) | 150 | 150 | 150 | 150 |
充分混勻放置2min后,對照管和測定管8000g常溫離心10min,取200μL對照管和測定管的上清、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管于微量玻璃比色皿/96孔板中測定400nm處吸光值,記為A對照管、A測定管、A空白管、A標(biāo)準(zhǔn)管,ΔA=A測定管- A對照管,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管。空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次。 |
三、LPL活性計(jì)算
1、血清(漿)LPL活力計(jì)算
單位定義:在45℃,pH7.5條件下,每毫升血清每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。
LPL(U/mL)=ΔA÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中LPL活力計(jì)算
(1)按樣本質(zhì)量計(jì)算
單位定義:在45℃,pH7.5條件下,每克組織每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。
LPL(U/g 質(zhì)量)=ΔA÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))×V提取÷W÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:在45℃,pH7.5條件下,每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。
LPL(U/mg prot)=ΔA÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))×V提取÷(V提取×Cpr)÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:
單位定義:在45℃,pH7.5條件下,每104個細(xì)胞每分鐘水解產(chǎn)生1nmol 4-硝基苯*為一個酶活力單位。
LPL(U/104 cell)=ΔA÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))×V提取÷N÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N
C標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,0.3125μmol/mL;V提取:加入試劑一體積,1mL;T:反應(yīng)時間,10min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;N:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),以萬計(jì);1000:單位換算系數(shù),1μmol=1000nmol。
注意事項(xiàng):
1、 測定管加入試劑二后混變渾濁為正?,F(xiàn)象。
2、 若A大于2,將粗酶液用試劑一稀釋后再進(jìn)行測定。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例:
1、 取0.1g大鼠肌肉加入1mL試劑一,取上清后按照測定步驟操作,用96孔板測得計(jì)算ΔA=A測定管- A對照管=0.367-0.128=0.239,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.378-0.046=0.332,按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得:
LPL(U/g 質(zhì)量)= 31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=31.25×0.239÷0.332÷0.1=224.96 U/g 質(zhì)量。
2、 取兔血清直接按照測定步驟操作,用96孔板測得計(jì)算ΔA=A測定管- A對照管=0.750-0.152=0.598,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.378-0.046=0.332,按血清(漿)體積計(jì)算酶活得:
LPL(U/mL)=31.25×ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=31.25×0.598÷0.332=56.29 U/mL。
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