肝脂酶（HL）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2385

規(guī)格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、試劑三：臨用前加入10 mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的 2-8℃保存8周；

2、試劑四：臨用前取1支加入1 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑可-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；

3、標準品：臨用前加入6.94 mL丙 酮，配成10 μmol/mL α-萘酚標準溶液，充分溶解待用，用不完的-20℃保存4周。

產品說明：

肝脂酶（hepaticlipase，HL）是一種脂肪分解酶，在肝實質細胞中合成，存在于肝臟竇周間隙內皮細胞表面和竇周間隙腔面的肝細胞微絨毛表面，可水解各種脂蛋白中的甘油三酯（TG）和磷脂（PL），使各種脂蛋白顆粒的大小和密度發(fā)生變化，當血漿中的HL及其活性增高時，可導致血漿中低密度脂蛋白（LDL）水平升高，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。

肝脂酶水解α-乙酸萘酯產生α-萘酚，可與固藍B鹽形成紫紅色偶氮化合物，在595nm有特征吸收峰，其顏色深淺在一定范圍內與肝脂酶活性成正相關。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、天平、低溫離心機、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、EP管、 丙 酮、蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL試劑一），加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10 min，取上清待測。

2、細胞：按照細胞數量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬細胞加入1 mL試劑一）加入試劑一，冰浴超聲波破碎細胞（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min）；然后于4℃，10000g離心10 min，取上清待測。

3、血清/血漿：直接測定。（若液體有渾濁則離心后進行測定）

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長至595 nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2、 將試劑三在30℃預熱20 min以上。

3、 將10 μmol/mL 的標準溶液用試劑一稀釋為5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078 μmol/mL的標準溶液備用。

4、 標準品稀釋表

實驗中每個標準管需20µL標準溶液。

5、 操作表（在1.5mLEP管或者96孔板中依次加入下列試劑）：

三、HL酶活計算

1、 標準曲線的繪制：

根據標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA（y，ΔA）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2、 HL酶活的計算：

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（U/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.1x÷Cpr

（2）按樣本質量計算

酶活定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（U/g 鮮重）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T=0.1x÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活定義：每10⁴個細胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（U/10⁴ cell）=x×V樣÷（V樣×N÷V樣總）÷T=0.1x÷N

（4）按液體體積計算

酶活定義：每毫升血清每分鐘水解α-乙酸萘酯產生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。

HL活性（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=0.1x

V樣：反應體系中加入樣本體積，0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；V樣總：加入試劑一體積，1 mL；T：反應時間，10 min；N：細胞數量，以萬計。

注意事項：

1、 若樣本為動物肝臟，建議將樣本用試劑一稀釋25倍以上再進行檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

2、 若樣本為肥胖型動物血清或血漿，建議將樣本用試劑一稀釋5倍以上再進行檢測，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

3、 當ΔA大于1.3時，建議將樣本用試劑一稀釋后再進行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數。

實驗實例：

1、取0.1g大鼠肝臟，進行樣本處理，取上清稀釋24倍后按照操作步驟進行操作，使用96孔板測得計算ΔA=A測定管-A對照管=0.605-0.046=0.559，帶入標準曲線y=0.265x+0.0033計算x=2.097，按照樣本質量計算酶活得：

HL活性（U/g 質量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T×24=50.328 U/g 質量。

2、取火雞血清稀釋6倍后按照操作步驟進行操作，使用96孔板測得ΔA=A測定管-A對照管=0.449-0.003=0.446，帶入標準曲線y=0.265x+0.0033計算x=1.671，按照樣本質量計算酶活得：

HL活性（U/g 質量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T×6=1.003 U/g 質量。

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