果糖-1, 6-二磷酸醛縮酶（FBA）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC2275

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入2 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

2、 試劑三：臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

3、 試劑四：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑-分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

4、 試劑五：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

果糖1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose 1,6 bisphosphate aldolase，FBA）（EC4.1.2.13）是糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑及光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶，催化果糖1,6-二磷酸可逆的裂解為磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)，在各種逆境脅迫下表現(xiàn)不同的響應(yīng)。

果糖1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構(gòu)酶和α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化NADH和磷酸二羥丙酮生成NAD和α-磷酸甘油，340nm處吸光值的變化可反映果糖1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、低溫離心機(jī)、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、漩渦震蕩儀、超聲破碎儀、冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

①總FBA酶：

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一）充分冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

細(xì)菌或細(xì)胞：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

液體：直接檢測(cè)。

②胞漿和葉綠體FBA酶的分離：

（1） 按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5-10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），手工快速研磨或勻漿，之后于4℃，200g離心5min；

（2） 棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min（離心時(shí)緩慢加速和降速）；

（3） 取上清用于測(cè)定胞漿FBA酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，上清即為葉綠體中FBA酶活性。

建議測(cè)定總FBA酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的FBA，則按照步驟②提取粗酶液。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定：(在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑)

注意：如果檢測(cè)樣本量大，可以將試劑一、二、三、四、五按照5:1:1:1:1（V:V:V:V:V）的比例配成工作液待用（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

三、FBA酶活計(jì)算

A、 按微量石英比色皿計(jì)算：

1、按蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBA酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每g組織每分消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBA酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

3、按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBA酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）4、按液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBA酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

B、按96孔UV板計(jì)算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1、若ΔA大于0.8建議將樣本用相應(yīng)提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧龠M(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、若是植物樣本，建議在提取完成后2h內(nèi)檢測(cè)完，如果樣本量過大，建議分批提取、檢測(cè)。

3、由于提取液一中含有一定濃度的蛋白（約0.5mg/mL），所以在測(cè)定樣品蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g小鼠肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清稀釋8倍后按照測(cè)定步驟操作，使用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.3061-1.125=0.1811，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.1983-1.1858=0.0125，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.1811-0.0125=0.1686，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活：

FBA酶活（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W×8（稀釋倍數(shù)）= 321.54×0.1686÷0.1×8（稀釋倍數(shù)）=4337 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g綠蘿加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測(cè)定步驟操作，使用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.4458-1.37=0.0758，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.1983-1.1858=0.0125，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.0758-0.0125=0.0633，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活：

FBA酶活（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W=321.54×0.0633÷0.1=204 U/g 質(zhì)量。

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