肉桂醇脫氫酶（CAD）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC4170
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：內(nèi)含不溶物，使用前搖勻。

2. 試劑一：臨用前加入15 mL試劑三溶解?？扇芙夂蠓盅b-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

3. 試劑二：液體置于試劑瓶內(nèi)玻璃管中。臨用前加入15 mL乙醇充分混勻，配好后2-8℃保存。

4. 工作液的配制：將試劑一、試劑二、試劑三按1:1:2（V:V:V）的比例配制工作液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：
CAD 是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，催化香豆醛、芥子醛以及松柏醛等生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于高等植物、酵母、菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
CAD 催化肉桂醛和NADPH生成肉桂醇和NADP⁺，在340nm下測定NADPH消耗速率，即可反映CAD活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰、乙醇和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清，置冰上待測。
2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：

三、CAD酶活計算

1. 按蛋白濃度計算

酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
CAD酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=321.54×ΔA÷Cpr

1. 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
CAD酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=321.54×ΔA÷W

1. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
CAD酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.643×ΔA
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，5min；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
注意事項：
1、當(dāng)A1小于0.8，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定。
2、空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.04。
實驗實例：

1. 取約0.1g三葉草葉，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清，按照測定步驟操作，測定計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.532-1.462=0.07，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.012-1.007=0.005，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.07-0.005=0.065，按樣本質(zhì)量計算得：CAD酶活（U/g 質(zhì)量）=321.54×ΔA÷W=209.001 U/g 質(zhì)量。

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