品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC1085 |
規(guī)格 | 100T/96S | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 測定意義:ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶,催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換,在很多生理 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
乙醇脫氫酶(ADH)活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意:本產(chǎn)品試劑有所變動,請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號:BC1085
規(guī)格:100T/96S
產(chǎn)品組成:使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
粉劑一 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
提取液:臨用前將粉劑一倒入提取液中,溶液為懸濁液,使用前需搖勻;
試劑二:臨用前取1支試劑二加入1mL蒸餾水,可以-20℃分裝保存4周,避免反復(fù)凍融。1支即可做100T,為延長試劑盒使用時(shí)間,遂多給一支。
產(chǎn)品說明:
ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶,催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換,在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH主要在肝臟生成,肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。
ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+,NADH在340nm處有吸收峰,而NAD+沒有;測定340nm 吸光度下降速率,來計(jì)算ADH活性。
注意:實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品:
冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,具體比例可以參考文獻(xiàn))
1、 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿。16000g,4℃離心20min,取上清置冰上待測。
2、 細(xì)菌、細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300W,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);16000g,4℃離心20min,取上清液置冰上待測。
3、血清等液體:直接測定。
二、測定步驟
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到340nm,紫外分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。
試劑一在25℃水浴中保溫30min以上。
空白管:在微量石英比色皿//96孔板(UV板)中依次加入20μL蒸餾水、8μL試劑二、152μL試劑一和20μL試劑三,迅速混勻后于340nm測定吸光值變化,分別記錄15s和75s時(shí)吸光值,分別記為A1和A2。ΔA空白管=A1-A2。(空白管只需做1~2個)
測定管:在微量石英比色皿//96孔板(UV板)中依次加入20μL上清液、8μL試劑二、152μL試劑一和20μL試劑三,迅速混勻后于340nm測定吸光值變化,分別記錄15s和75s時(shí)吸光值,分別記為A3和A4。ΔA測定管=A3-A4。
三、ADH活性計(jì)算
a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/mg prot) =[(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106]÷(Cpr×V樣)÷T
=1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管) ÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:25℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/g 質(zhì)量) =[(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:25℃中每104個細(xì)胞每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U /104 cell) = [(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:25℃中每毫升樣本每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/mL) = [(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106]÷V樣÷T=1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)
ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4L;106:單位換算系數(shù),1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min;細(xì)胞數(shù)量:以萬計(jì)。
b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下
(1)按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/mg prot) =[(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106]÷(Cpr×V樣)÷T
=2.68×(ΔA測定管–ΔA空白管) ÷Cpr
(2)按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:25℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/g 質(zhì)量) =[(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106]÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=2.68×(ΔA測定管–ΔA空白管)÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:25℃中每104個細(xì)胞每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/104 cell) = [(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=2.68×(ΔA測定管–ΔA空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:25℃中每毫升樣本每分鐘氧化1μmol NADH為1個酶活單位。
ADH (U/mL) = [(ΔA測定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反總×106]÷V樣÷T=2.68×(ΔA測定管–ΔA空白管)
ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光徑,0.6cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4L;106:單位換算系數(shù),1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,需要自行測定;W:樣本質(zhì)量,g;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02mL;V樣總:提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1min;細(xì)胞數(shù)量:以萬計(jì)。
注意事項(xiàng):
若A3大于1.5或者A3小于A1,則需要將樣本用蒸餾水稀釋再進(jìn)行測定,計(jì)算公式注意乘以稀釋倍數(shù)。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例:
取0.1g大鼠肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨,取上清后按照測定步驟操作,用微量石英比色皿測得計(jì)算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007,ΔA測定管=A3-A4=0.8351-0.5341=0.301,按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得:
ADH (U/g 質(zhì)量) =1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)÷W=1.61×(0.301-0.007)÷0.1=4.7334 U/g 質(zhì)量。
取馬血清直接檢測,用微量石英比色皿測得計(jì)算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007,ΔA測定管=A3-A4=0.6369-0.6036=0.0333,按液體體積計(jì)算酶活得:
ADH ((U/mL) =1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)=1.61×(0.0333-0.007)=0.042343 U/mL。
取小鼠血漿直接檢測,用微量石英比色皿測得計(jì)算ΔA空白管=A1-A2=0.5718-0.5648=0.007,ΔA測定管=A3-A4=0.7381-0.7093=0.0288,按液體體積計(jì)算酶活得:
ADH (U/mL) =1.61×(ΔA測定管–ΔA空白管)=1.61×(0.0288-0.007)=0.035098 U/mL。
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