漆酶活性檢測(cè)試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號(hào)：BC1630

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 工作液的配制：一瓶試劑二用25 mL試劑一溶解。現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

漆酶（CE1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍(lán)氧化酶家族，漆酶存在菇、菌及植物中，是一種環(huán)保型酶，其催化性質(zhì)在生物檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用。

漆酶分解底物ABTS產(chǎn)生ABTS自由基，在420nm處的吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于底物ABTS，測(cè)定ABTS自由基的增加速率，可計(jì)算得漆酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、天平、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水，水浴鍋

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）   

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至420nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 水浴鍋溫度調(diào)至45℃。

3、 操作表：在1mL玻璃比色皿中分別加入下列試劑：

三、漆酶活計(jì)算

1、按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T=61.7×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克樣本每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T=61.7×ΔA÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×500÷V樣總）÷T=0.123×ΔA

4、按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL液體每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

漆酶酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T=61.7×ΔA

ε：ABTS摩爾消光系數(shù)：36000L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.001L；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測(cè)定；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3min；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1、工作液需臨用前配制，并且盡快使用，4℃保存一周，若變色則不能使用。

2、測(cè)定之前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，若吸光值較高，請(qǐng)將樣本用提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧贉y(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3、空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，OD值變化不超過0.05。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g香菇加1mL提取液進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A2測(cè)定-A1測(cè)定=0.657-0.084=0.573，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.087-0.058=0.029，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.573-0.029=0.544，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

漆酶酶活（U/g 質(zhì)量）=61.7×ΔA÷W=61.7×0.544÷0.1=335.648 U/g 質(zhì)量。

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