焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC3400

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加6 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存兩周，禁止反復(fù)凍融。

2、 試劑三：臨用前加6 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存兩周，禁止反復(fù)凍融。

3、 試劑四：臨用前取1支加入0.3 mL蒸餾水溶解備用，2-8℃保存一周。

4、 試劑五：臨用前取1支加入0.3 mL蒸餾水溶解備用，-20℃分裝保存一周，禁止反復(fù)凍融。

5、 試劑六：臨用前加入0.6 mL蒸餾水溶解備用，2-8℃保存一周，也可按比例現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于植物組織中，與磷酸果糖激酶一樣催化果糖-6-磷酸的磷酸化，單PEP催化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，并以焦磷酸代替ATP，在光合作用碳代謝中起重要作用。

PFP催化6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1,6-二磷酸果糖，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫u丙 酮，再由α-磷酸甘油脫氫酶和NADH 催化生成3-二磷酸甘油和NAD，340nm處的吸光度變化反映了PFP的活性的高低。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1 mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，20000 g離心15 min，取上清置冰上待測(cè)；

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300 W，超聲3 s，間隔7 s，總時(shí)間3 min）；然后4℃，20000 g離心15 min，取上清置冰上待測(cè)；

3、液體：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340 nm，蒸餾水調(diào)零。  

2、 操作表：

三、焦磷酸：果糖6-磷酸-1磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的計(jì)算

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（U/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PFP（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T=53.59×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1 cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V提取：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；10⁹：換算系數(shù)，1mol=10⁹ nmol。

注意事項(xiàng)：

1、每次檢測(cè)樣本數(shù)不宜太多以免耽誤過(guò)多的酶促反應(yīng)時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、取0.1g豆芽進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算 A1測(cè)定管-A2測(cè)定管=1.041-0.963=0.078、A1空白管-A2空白管=0、ΔA=（A1測(cè)定管-A2測(cè)定管）-（A1空白管-A2空白管）=0.078，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

PFP（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(W ×V樣÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷W=41.8 U/g 質(zhì)量。

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