二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0440
規(guī)格：25T/24S、50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

25T溶液的配制：

1. 試劑三：臨用前取1支加入0.5mL蒸餾水充分溶解待用，振蕩溶解后若出現(xiàn)渾濁可以離心使用；

2. 試劑四：臨用前加入1mL 蒸餾水充分溶解待用；

3. 工作液的配制：臨用前在試劑二中加入全部試劑一，充分混勻，在25℃孵育5min。

50T溶液的配制：
1、試劑三：臨用前取1支加入1 mL蒸餾水充分溶解待用，振蕩溶解后若出現(xiàn)渾濁可以離心使用；
2、試劑四：臨用前加入2 mL 蒸餾水充分溶解待用；
3、工作液的配制：臨用前在試劑二中加入全部試劑一，充分混勻，在25℃孵育5min。
產(chǎn)品說明：
1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco, EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一個關鍵酶，既控制著CO₂的固定，同時又制約著碳素向Calvin循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流，其活性的大小直接影響著光合速率。在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）與1分子的CO₂結(jié)合，產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA）；PGA可通過外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，伴隨著NADH氧化生成NAD⁺；在340nm NADH有特征吸收峰，而NAD⁺沒有此吸收峰，因此測定340nm吸光度下降速率可以代表Rubisco的羧化酶活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：

• 樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、細菌或細胞樣本的制備：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、稱取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。建議選取新鮮的植物樣本。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 按下表步驟加樣：

記錄340nm處20s時吸光值A1和5min20s時的吸光值A2，計算ΔA測定=A1測定-A2測定。ΔA空白=A1空白-A2空白；ΔA =ΔA測定-ΔA空白。反應溫度保持在25℃。（空白管只做1-2管）
三、Rubisco活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol NADH為一個酶活力單位。
Rubisco活力（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T =344×ΔA÷Cpr

1. 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：25℃中每 g組織每分鐘氧化1 nmol NADH為一個酶活力單位。
Rubisco活力（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=344×ΔA÷W

1. 按細菌或細胞數(shù)量計算

單位的定義：25℃中每1萬個細菌或細胞每分鐘氧化1 nmol NADH為一個酶活力單位。
Rubisco活力（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=0.69×ΔA
V反總：反應體系總體積，1.07×10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5min；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。
實驗實例：

1. 取0.1g植物葉片，加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.279-1.206=0.073，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.834-0.823=0.011，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.073-0.011=0.062，按樣本質(zhì)量計算酶活得：Rubisco活力（U/g 質(zhì)量）=344×ΔA÷W=344×0.062÷0.1=213.28 U/g 質(zhì)量

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