糖原合成酶（GCS）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC3335

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑四：用前取1支加入1.5 mL試劑一充分溶解，-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑五：用前取1支加入1.5 mL試劑一充分溶解，-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3、 工作液的配制：臨用前將試劑三離心，取10 μL試劑三，加7 mL試劑一、1.5 mL試劑四、1.5.mL試劑五，充分混合（約66T），現(xiàn)用現(xiàn)配，也可根據(jù)樣本量按比例配制；

4、 試劑八的配制：

（1） 臨用前取1瓶試劑八加入2.5 mL試劑二溶解，再加入1支試劑七溶解，可-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

（2） 用前試劑六先離心，取14 μL試劑六加入1.46mL上述（1）中溶液，充分混合（約36T），現(xiàn)用現(xiàn)配，也可根據(jù)樣本量按比例配制。

產(chǎn)品說(shuō)明：

糖原合成酶（Glycogen synthase , GCS）將UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非還原端，以α-1,4糖苷鍵連接。GCS是動(dòng)物機(jī)體糖原合成過(guò)程的限速酶，同時(shí)也是胰島素作用的主要靶酶，在糖代謝及維持血糖相對(duì)穩(wěn)定的過(guò)程中有著重要作用。

GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH生成NAD⁺，在340 nm下測(cè)定NADH的下降速率，即可反映GCS活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、超聲破碎儀、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1:5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，8000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）:提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率200w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

血清等液體：直接檢測(cè)。（若溶液渾濁則離心后取上清進(jìn)行測(cè)定）

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，紫外分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 臨用前將工作液與試劑八置于37℃水浴鍋中預(yù)熱5min（工作液用多少預(yù)熱多少）。

3、 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑：

三、GCS酶活計(jì)算

A、按微量石英比色皿計(jì)算：

1. 按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T=3215.4×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克樣本每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T =3215.4×ΔA÷W

3. 按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)））÷T

=3215.4×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

4. 按液體體積計(jì)算

酶活定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T =3215.4×ΔA

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；V

反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間：1min。

B、按96孔UV板計(jì)算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g小鼠心臟加入1mL提取液進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.2455-1.1883=0.0572，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9639-0.9529=0.011，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.0572-0.011=0.0462，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

GCS酶活（U/g 質(zhì)量）=3215.4×ΔA÷W=1485.5 U/g 質(zhì)量。

注意事項(xiàng)：

1、 樣本提取上清液置于冰上待測(cè)，提取樣本建議當(dāng)天測(cè)完。

2、 若ΔA大于0.2，建議將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，以提高檢測(cè)靈敏度，并在計(jì)算公式中乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

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