硫化氫（H₂S）含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC2050

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

產(chǎn)品說明：

硫化氫（H₂S）是一種新型氣態(tài)信號分子，存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，生理濃度的H₂S對神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長時(shí)程增強(qiáng)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，并對自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發(fā)揮著重要的病理生理效應(yīng)。其在植物中也具有促進(jìn)種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)植物氣孔、增強(qiáng)光合作用等作用，同時(shí)還會影響植物體內(nèi)的氧化還原平衡和物質(zhì)代謝。

H₂S與N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應(yīng)生成亞甲基藍(lán)，亞甲基藍(lán)在665nm處有最大吸收峰，通過測定其吸光值可計(jì)算H₂S含量。

H₂S + N, N-Dimethyl-p-Phenylenediamine + Ferric Ammonium Sulfate       Methylene Blue(665nm)

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液一體積（mL）=500-1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min），12000g 4℃離心10min；然后取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g 4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

2. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1:5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一），進(jìn)行冰浴勻漿；12000g 4℃離心10min；然后取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g 4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清（漿）或其它液體樣本：取100μL血清（漿）或其它液體樣本加入1mL提取液一，12000g 4℃離心10min；然后取0.8mL上清液，再加入0.15mL提取液二，12000g 4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至665nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表（按順序在EP管中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置10min后，665nm處測定各管吸光值A，分別記為A測定、A空白，計(jì)算ΔA=A測定-A空白?？瞻坠苤恍铚y1~2次。

三、H₂S含量計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（nmol/mL）為x軸，以其對應(yīng)的吸光值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y = 0.0026x-0.0268，R² = 0.9973；將ΔA帶入公式中得到x（nmol/mL）。

1. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

H₂S含量（nmol/g 質(zhì)量）= x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W

2. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

H₂S含量（nmol/mg prot）= x×V樣÷（Cpr×V樣）=x÷Cpr

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

H₂S含量（nmol/10⁴ cell）= x×（V上清+V提取液二）÷（cells×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷cells

4. 按照液體體積計(jì)算

H₂S含量（nmol/mL）= x×（V上清+V提取液二）÷[V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]= 13.0625×x

V上清：提取時(shí)上清液的體積：0.8mL；V提取液一：加入提取液一的體積：1mL；V提取液二：加入提取液二的體積：0.15mL；V樣本：反應(yīng)液中加入樣本的體積，0.25mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；cells：細(xì)胞數(shù)量，10⁴個(gè)；V液體：液體樣本體積：0.1mL。

注意事項(xiàng)：

1.  如果ΔA值過低或接近空白值，建議增加樣本量后再進(jìn)行測定；如果ΔA＞0.6，建議稀釋樣本后再進(jìn)行測定，計(jì)算公式中要乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

2. 提取液中含有蛋白沉淀劑，若按蛋白濃度計(jì)算需要另取樣本重新提取測定蛋白濃度

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g小鼠肝臟按照樣本提取步驟處理，按照測定步驟操作，使用玻璃比色皿測定665nm處反應(yīng)液吸光度，計(jì)算ΔA= A測定-A空白=0.090-0.026=0.064，將ΔA代入標(biāo)準(zhǔn)方程y = 0.0026x-0.0268，R² = 0.9973，按照樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

H₂S含量（nmol/g 質(zhì)量）= x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）= 414.71nmol/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g銀杏*片按照樣本提取步驟處理，按照測定步驟操作，使用玻璃比色皿測定665nm處反應(yīng)液吸光度，計(jì)算ΔA= A測定-A空白=0.081-0.026=0.055，將ΔA代入標(biāo)準(zhǔn)方程y = 0.0026x-0.0268，R² = 0.9973，按照樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：    

H₂S含量（nmol/g 質(zhì)量）= x×（V上清+V提取液二）÷ （W×V上清÷V提取液一）=373.61nmol/g 質(zhì)量。

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