雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 基因工程
產(chǎn)品 說明 ：
    報告基因檢測，是真核基因表達調(diào)控研究的常用方法。由于檢測光量子的方法非常敏感，采用生物發(fā)光(bioluminescent) 法，是報告基因檢測常用的有效手段。熒光素酶(luciferase) 催化底物熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)射出光子。螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)和海腎熒光素酶(Ranilla luciferase) 催化的發(fā)光反應(yīng)，具有相似的光學(xué)特征和很好的濃度線性范圍(7~8 個數(shù)量級的線性范圍) ，酶的檢測靈敏度達 10 -18 mol 到 10 -20 mol，
但兩者催化的化學(xué)反應(yīng)底物和適反應(yīng)條件*不同。這兩種熒光素酶配合形成了十分有效的雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，其中 Ranilla luciferase 通常作為內(nèi)參照。
    本試劑盒提供了一體化形式的雙熒光素酶檢測系統(tǒng)。采用通用裂解緩沖液，適合于兩種熒光素酶活性的保持，且與其他類型的報告基因檢測和蛋白含量檢測兼容；優(yōu)化的兩種酶反應(yīng)體系，使每種發(fā)光反應(yīng)持續(xù)數(shù)十分鐘， 以便于手工操作多個樣品； 并保證 Firefly luciferase 發(fā)光及時淬滅， 不影響后續(xù) Ranilla luciferase的測定；優(yōu)化的反應(yīng)體系還使兩種熒光素酶活性比值趨于合理的敏感范圍，更有利于后續(xù)數(shù)據(jù)的比較。

產(chǎn)品內(nèi)容：
名稱  數(shù)量  保存條件
5x Universal Lysis Buffer (通用裂解液) 25 ml  -20 ℃
Fassay Buffer I (蟲酶緩沖液)  10 ml  -20℃
Fassay Substrate I (蟲酶底物)  0.5 ml  -20℃
Rassay Buffer II ( 海酶緩沖液)  10 ml  -20℃
Rassay Substrate II ( 海酶底物)  0.2 ml  -20℃
可作 100 次雙熒光素酶檢測。低溫運輸，-20 ℃或-80 ℃避光保存。有效期 6 個月。
洚備試劑 ：
PBS、雙蒸水等。

操洽步驟 ：
一 、 裂解細胞 ：
1) 新鮮配制裂解液：臨用前，取適量 5xUniversal Lysis Buffer (ULB)，用雙蒸水稀釋 1xULB ，混勻。1xULB 可在 4℃存放數(shù)周。
2) 細胞清洗：傾去培養(yǎng)板/皿中的培養(yǎng)液，加入足量 PBS ，輕輕洗滌細胞。*傾去洗滌液。
3) 細胞裂解：推薦按照表中的體積，在孔/皿中加入 1xULB ，混勻。培養(yǎng)板可在微型振蕩器上震蕩 5~10min ；培養(yǎng)皿可直接用細胞刮刀刮下細胞，將細胞懸液移入 1.5 ml 離心管，在渦旋振蕩器上充分混懸震蕩30 秒。裂解細胞懸液可直接用于發(fā)光測定，也可離心 30 秒，取上清做發(fā)光測定。
表：不同容器細胞所需 1xULB 的體積。
96 孔板 48 孔板 24 孔板 12 孔板 6 孔板 35 mm 平皿 60 mm 平皿
30µl  60µl  120µl 250µl 500µl  500µl  1000µl

二 、 配制發(fā)光反應(yīng)液 ：
測定前，在室溫待 Fassay Buffer I 、Fassay Substrate I 、Rassay Buffer II 和 Rassay Substrate II 溶化，混勻（注意避光）。按 20/1 比例用 Fassay Buffer I 稀釋 Fassay Substrate I ，按 50/1 比例用 Rassay Buffer II稀釋 Rassay Substrate II，分別配制所需體積的 Fassay Reagent I 和 Rassay Reagent II （注意避光）。

三 、 測定儀器的設(shè)置 ：
按儀器操作說明開啟發(fā)光測定儀。手動操作型儀器，將測讀時間設(shè)為 10~20 秒。自動操作型儀器，一般將測定延遲設(shè)為 2 秒，將測讀時間設(shè)為 10~20 秒，F(xiàn)assay Reagent I 和 Rassay Reagent II 的注入體積設(shè)定為 100 µl。

四 、 手動發(fā)光測定 ：
取待測樣品 20 µl 加入測量管底部，取 Fassay Reagent I 100 µl 加入管底部，輕輕敲擊管壁 3~5 次混勻，放入儀器中立即測定，記錄發(fā)光值為 Firefly luciferase 的發(fā)光單位(RLU) ；
取 Rassay Reagent II 100 µl 加入管底部，輕輕敲擊管壁 3~5 次混勻，放入儀器中立即測定，記錄發(fā)光值為 Ranilla luciferase 的發(fā)光單位(RLU) 。如用多孔板同時手動測定多個樣品，則將各待測樣品 20 µl 分別加入連續(xù)的各孔底部，用多道加樣器于各孔底加入 Fassay Reagent I 100 µl，輕輕敲擊板側(cè) 3~5 次混勻，放入儀器中立即測定，記錄發(fā)光值為 Firefly luciferase 的發(fā)光單位(RLU) ；取 Rassay Reagent II 100 µl 立即加入管底部， 輕輕敲擊板壁3~5次混勻， 放入儀器中立即測定， 記錄發(fā)光值為Ranilla luciferase的發(fā)光單位(RLU) 。

五 、 自動發(fā)光測定 ：
配制好的 Fassay Reagent I 和 Rassay Reagent II 置于測定儀內(nèi)并連接好對應(yīng)管道， Fassay Reagent I 接*注射管道，Rassay Reagent II 接第二注射管道。各待測樣品 20 µl 分別加入測定管/板孔底部，啟動自動測量程序。記錄 Firefly luciferase 和 Ranilla luciferase 的發(fā)光單位(RLU) 。

注意事項 ：
1) Fassay Buffer I 和 Fassay Substrate I 應(yīng)避免反復(fù)凍熔，可分裝成合適體積分次使用。Rassay Substrate II溶液應(yīng)蓋嚴存放， 避免蒸發(fā)。 配制好未用完的 Fassay Reagent I 和 Rassay Reagent II 可在-20℃保存 1 月左右。
2) 細胞裂解液一般在當天測定。如需隔日測定，應(yīng)將樣品于-20℃保存。長期保存應(yīng)在-80℃。測定樣品量可為 10~30µl。
3) 用多孔板同時手動測定多個樣品時，要盡量保證每個樣品的兩種試劑加入時間間隔*。
4) Rassay Reagent II 可用于直接測定樣品的 Ranilla luciferase 。需要注意的是，Rassay Reagent II 直接測量的 RLU 要比雙熒光素酶順序檢測獲得的 RLU 高一些（反應(yīng)體積等因素的影響）。

相關(guān)文獻：

《Long non-coding RNA MBNL1-AS1 regulates proliferation, migration, and invasion of cancer stem cells in colon cancer by interacting with MYL9 via sponging microRNA-412-3p》 作者:Kongxi Zhu，Yunxia Wang，Lan Liu，Shuai Li，Weihua Yu 期刊:Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology 影響因子:2.807 PMID:31255531
《Effects of Srxn1 on growth and Notch signalling of astrocyte induced by hydrogen peroxide》 作者:Lan Li, Guangjun Lin, Huizi Gu, Lei Yu & Changwei Ni 期刊:Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology 影響因子:4.462 PMID:31079497
 

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