親和層析填料 苯甲脒-瓊脂糖凝膠 6B
貨號：S9390
規(guī)格 ：25ml /100ml

一、簡介
    苯甲脒類物質是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑，所以將這類物質偶聯到瓊脂糖凝膠6B上，可以從各種來源的樣品中一步純化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽釋放酶、前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。
   苯甲脒瓊脂糖凝膠由于應用新的活化方法所以流速高，非特異吸附少，而且填料粒度均勻，所以分離效果好，是純化絲氨酸蛋白酶類適合的填料。
二、親和填料特性

三、  適用范圍
    本一步從各種樣品中純化絲氨酸蛋白酶類物質。
四、應用實例
    實驗名稱：苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF 分離尿激酶。

實驗步驟：
   （1）苯甲脒瓊脂糖凝膠 FF 裝柱，1.6×20m，柱床體積為 10ml
   （2）用緩沖液 1 平衡 2-5 個床體積，流速為 2ml/min
   （3）取尿激酶粗品 200mg 溶解在 20ml 的緩沖液 1 中，用 0.45μm 的濾膜過濾，上樣，流速為 1ml/min
   （4）用緩沖液 1 再洗 2-5 個床體積，流速為 2ml/min
   （5）后緩沖液 2 進行洗脫，流速為 2ml/min，收集洗脫峰，用 SDS-PAGE 純化后的效果。
   （6）用純水洗 5 個柱床體積，然后分別用 100mM，pH8.0Tris-HCl 緩沖液含 1M NaCl 和 100mM,pH4.0的醋酸緩沖液含 1M NaCl 交替洗滌 3 次， 再用純水洗 3 個柱床體積， 然后再用 20%的乙醇流洗 3 個柱床體積，流速為 2ml/min，柱子置于+4~8℃環(huán)境中保存。
   （7）色譜圖見圖 1，SDS-PAGE 結果見圖 2。 緩沖液組成：

緩沖液 1：100mM pH7.4 的 PBS 緩沖液；緩沖液 2：100mM 醋酸緩沖液，pH4.0。
也可以用這個填料特異去除各種融合蛋白酶切后的絲氨酸蛋白酶，例如凝血酶以及胰蛋白酶類蛋白酶。
    例如去除凝血酶上樣緩沖液為： 50mM pH7.4 的 PBS 緩沖液含 0.15M NaCl,洗脫緩沖液為： 50mM pH7.4 的 PBS緩沖液含 1M NaCl。

SDS-PAGE 流程：
   （1）BSA 法測量樣品蛋白濃度；
   （2）根據測定樣品的蛋白濃度，算出 5-10μg/孔所需的體積；
   （3）向 1.5ml EP 管中加入含 5-10μg 蛋白的樣品溶液，若體積小于 10μL，則加 20mM PBS pH7.4 補足 10μl；若體積大于 10μl，則要加入 1ml 無水乙醇，－20℃下濃縮 1h；
   （4）取濃縮樣品 10000rpm 離心 15min，除去上清，37℃烘箱 10min 去除殘余的乙醇；
   （5） 在樣品加入 20mM PBS pH7.4 和 2×loading buffer 各 10μl， 100℃下 10min。 取出后用冷卻 30s， 4000rpm離心 1s；
   （6）點樣，電泳。

五、注意事項：
5.1 色譜柱裝填
   1、所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體好做脫氣處理。
   2、在柱子下端加入蒸餾水，以除去柱子中的空氣，關閉柱子出口，在柱內保留少量的蒸餾水。
   3、將瓊脂糖凝膠連續(xù)倒入柱子時，要用玻璃棒的緊靠柱子內壁引流，以減少氣泡的產生，讓填料先自然沉降。
   4、柱壓不超過 0.3MPa，如果裝柱系統(tǒng)中無法測柱壓，則控制流速高于 300cm/h，但是在使用中一般只用大流速的 75%。
   5.2 蛋白的結合
      平衡緩沖液可以采用如下配方：100mM pH7.4 的 PBS 緩沖液，0.1M NaCl，pH8.0。上樣完畢后，繼續(xù)用平衡緩沖液洗柱子，直到基線平穩(wěn)。
   5.3 蛋白的洗脫
  （1）洗脫可以采取特異性或者非特異性洗脫。
  （2）特異性洗脫可以用目標分子的競爭劑，對氨基苯甲脒的抑制劑。對非特異性洗脫而言，可以選用以下幾種方法：
      a 改變離子強度，通常加入 1M 的 NaCl，必要的話可以采用階段洗脫或線性梯度洗脫。
      b 改變 pH，可采用階段洗脫洗脫或線性梯度洗脫來達到目的。
      c 降低洗脫緩沖液的極性。如可以在洗脫緩沖液中加入 10%的二氧六環(huán)等。
      d 使用變性劑。如在洗脫緩沖液中加入尿素、鹽酸胍等。

六、再生、清洗
6.1  再生
    用純水洗5個柱床體積，然后分別用100mM，pH8.0Tris-HCl緩沖液含1M NaCl和100mM,pH4.0的醋酸緩沖液含
    1M NaCl交替洗滌3次，再用水洗3個柱床體積，然后再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+4~8℃環(huán)境中。
    如果在色譜操作過程中用到了變性劑或者去污劑，也可以用上述方法洗柱子。
6.2  清洗
在應用中，柱子上結合的一些物質如變性蛋白和脂質等不能通過再生過程去除，這種情況下，可以用去污劑如0.1%Triton X-100在37℃洗柱子1min。之后立即用5個床體積的平衡液洗柱子。
七、保存
在20%乙醇中，4℃下長期保存。

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