人核基質(zhì)蛋白22（NMP-22）酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書

人核基質(zhì)蛋白22（NMP-22）酶聯(lián)免疫分析試劑盒

基質(zhì)蛋白：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關液體樣本中核基質(zhì)蛋白22（NMP-22）的含量。
基質(zhì)蛋白實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）水平。用純化的
人核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加
入核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22），再與 HRP 標記的核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）抗體結(jié)合，形成
抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在HRP 酶的催化下
轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的核基質(zhì)蛋白 22
（NMP-22）呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算
樣品中人核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）含量。
基質(zhì)蛋白樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上
清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心
20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次
離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程
中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS （PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞
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濃度達到100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心 20分
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS ，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS （PH7.4），用手工或勻漿器
將標本勻漿充分。離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待
檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上
進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP ）活性。
基質(zhì)蛋白操作步驟
1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10孔，在*、第二孔中分別加標
準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后從*孔、第二
孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，
混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔
中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul ，混勻；混勻后從第五、第六孔中各
取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl，混
勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準
品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，
濃度分別為 9 U/ml ，6 U/ml ，3 U/ml ，1.5 U/ml ， 0.75 U/ml ）。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣
品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣
品終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混
勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將 30（48T 的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T 的20倍）倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30秒后棄去，如此
重復5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止
液后15分鐘以內(nèi)進行。
基質(zhì)蛋白注意事項：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好
控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值
大于標準品孔*孔的 OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
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5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù) R 值為0.95 以上。
2. 批內(nèi)與批間應分別小于 9%和11%