IHC是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的應(yīng)用技術(shù)，應(yīng)用過(guò)程中常出現(xiàn)各種問(wèn)題，例如檢測(cè)結(jié)果陰性，非特異性染色，染色強(qiáng)度不夠，著色不均，脫片，干片等。因此索萊寶為大家總結(jié)了一些IHC常見(jiàn)問(wèn)題及處理方法，來(lái)幫助您改進(jìn)IHC檢測(cè)，減少您的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過(guò)程，快速達(dá)到預(yù)期結(jié)果。

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a）甲醛：甲醛是保留組織和細(xì)胞內(nèi)蛋白靶點(diǎn)的常用固定劑，是大多數(shù)IHC/ICC應(yīng)用的良好選擇，但并不是一種通用的固定劑。醛的過(guò)度固定會(huì)修飾氨基酸（屬于表位中的一部分），并阻斷抗體與之結(jié)合。然而大部分情況下，利用抗原修復(fù)技術(shù)可暴露表位，以還原抗體結(jié)合。研究表明甲醛會(huì)誘導(dǎo)磷酸化依賴表位的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位，從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)。在這種情況下，冰預(yù)冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇是適當(dāng)?shù)奶娲?/p>

b）醇類：常用于細(xì)胞和組織固定的醇類是甲醇和乙醇。通常認(rèn)為醇類不像甲醛固定劑那樣保留組織形態(tài)，不像甲醛那樣滲透，主要用于固定冰凍組織切片和細(xì)胞。在醇類固定之后不推薦進(jìn)行抗原修復(fù)。

c）丙酮：丙酮是一種強(qiáng)的脫水劑，能引起組織蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷凍組織的切片。

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a）培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞的固定時(shí)間與組織相比較短，且固定液的濃度更低。例如，用2%甲醛溶液在室溫下固定20min，足以保留細(xì)胞形態(tài)和抗原性。

培養(yǎng)細(xì)胞的固定通常只是去除培養(yǎng)基，并加入固定液即可。不過(guò)，去除培養(yǎng)基后表面張力的變化可能損害某些細(xì)胞類型。如果是這種情況，固定劑可直接加入培養(yǎng)基中。例如，加入與培養(yǎng)基相同體積的4%甲醛，將得到2%甲醛溶液，它足以預(yù)固定細(xì)胞。2min后，預(yù)固定培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)替換成新鮮的2%固定劑。預(yù)固定步驟讓細(xì)胞更加堅(jiān)硬，這樣它們就能夠承受表面張力改變所引起的任何可能的有害影響。

b）組織：對(duì)于小組織來(lái)說(shuō)，浸入固定溶液通常能獲得足夠的固定。可將解剖的組織浸潤(rùn)在固定劑中，但是如果將固定溶液經(jīng)由內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)（無(wú)論是通過(guò)心臟或通過(guò)腹主動(dòng)脈）灌注，則往往能獲得更快速、更均勻的固定。在研究小動(dòng)物的完整組織時(shí)，灌注固定是保留抗原的方法，包括用固定液來(lái)取代動(dòng)物的全身血液。4%甲醛是組織灌注和浸潤(rùn)固定的常用溶液。

為了在浸潤(rùn)固定過(guò)程中加強(qiáng)固定劑的滲透，建議組織厚度不超過(guò)5mm。對(duì)于完整的固定，固定劑的體積應(yīng)當(dāng)是組織體積的50-100倍。固定通常在室溫下進(jìn)行4-24小時(shí)。由于固定不足或固定過(guò)度可能降低或破壞組織的免疫反應(yīng)性，因此優(yōu)化條件很重要。

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由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇，通過(guò)抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。常用的修復(fù)方式一般分三種：高壓修復(fù)、微波修復(fù)、酶修復(fù)。

a）高壓修復(fù)是目前使用較多、較穩(wěn)定、可重復(fù)性較高的一種方法，操作簡(jiǎn)單，效果較好。但這種方法對(duì)修復(fù)的溫度和時(shí)間要求十分嚴(yán)格。我們常用的高壓鍋修復(fù)，溫度在110℃左右，修復(fù)時(shí)間為2.5min。

b）微波修復(fù)是較早采用的熱抗原修復(fù)技術(shù)，其方法受環(huán)境因素影響較大。微波修復(fù)偶爾也會(huì)出現(xiàn)同時(shí)修復(fù)的組織切片中以及同一切片的不同部位可能會(huì)出現(xiàn)修復(fù)效果不均勻的現(xiàn)象。比較適合高pH值的抗原修復(fù)液（EDTA、EGTA）修復(fù)。

c）酶修復(fù)法比較溫和，常用于脫片現(xiàn)象較嚴(yán)重的切片（如骨組織切片）。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。酶消化法進(jìn)行抗原修復(fù)，須嚴(yán)格控制濃度和作用時(shí)間，消化不足，不能充分暴露出組織抗原；過(guò)度的消化會(huì)破壞組織結(jié)構(gòu)，陽(yáng)性定位不明確。我們常用蛋白酶K修復(fù)，條件為37℃ 10min。

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內(nèi)源性過(guò)氧化物酶會(huì)與基質(zhì)溶液（過(guò)氧化氫和顯色劑，例如DAB）發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性。在與HRP偶聯(lián)抗體一起孵育之前，先用過(guò)氧化氫預(yù)處理樣本可以顯著降低這種非特異性背景。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶一般用3%過(guò)氧化氫孵育10min左右。

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