在免疫學實驗中，經(jīng)常需要將抗體標記上酶或者熒光素，大部分科研工作者一提到FITC熒光標記抗體往往會很畏懼，主要原因是不知道如何下手，參照一些文獻的方法和步驟做出來的結(jié)果往往不盡如人意，往往讓實驗人員畏而束手。

　　

　　FITC熒光素是目前較為常用的標記抗體的方法，F(xiàn)ITC一般呈黃色、褐色或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定在低溫中能保存數(shù)年。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基共價結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個FITC熒光標記抗體分子上能標記15~20個FITC分子，被標記的抗體仍能保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力，在熒光燈源紫外線或藍紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過熒光顯微鏡進行觀察或利用流式細胞儀分析，從而對抗原進行定性、定位或定量。

　　

　　FITC熒光標記抗體的標記方法主要有Marshall直接標記法、Chadwick間接標記法、改良標記法和透析法四種。下面，北京索萊寶科技小編將為大家主要講解Marshall直接標記法、Chadwick間接標記法，希望可以幫助到大部分科研工作者。

　　

　　一、Marshall直接標記法

　　

　　1、抗體的準備：取提純的Ig溶液測定蛋白質(zhì)含量，置于三角燒瓶中加入生理鹽水和0.5mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液，冰槽中攪拌5~10min；

　　

　　2、熒光素的準備：按每毫克蛋白質(zhì)加0.01~0.02mg的FITC計算，準確稱取后加入抗體溶液中；

　　

　　3、標記：邊攪拌邊加入熒光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰庫繼續(xù)攪拌12~18h；

　　

　　4、透析：結(jié)合完畢后，先將結(jié)合物以3000r/min離心20min，除去少量沉淀物后裝入透析袋中再置于pH8.0緩沖鹽的燒杯中透析過夜；

　　

　　5、過柱：取透析過夜的標記物，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離的FITC，收集標記的FITC熒光標記抗體進行鑒定。

　　

　　二、Chadwick間接標記法

　　

　　1、抗體的準備：0~4℃下，用0.01mol/LpH8.0PBS將待標記的抗體蛋白溶液稀釋到濃度為30~40mg/ml，置于三角燒瓶內(nèi)放入冰槽中；

　　

　　2、熒光素的準備：按每毫克蛋白質(zhì)加入0.01mg的熒光素稱取，溶解于等量的3%重碳酸鈉水溶液中；將抗體蛋白溶液與FITC溶液等量混合，在0~4℃中攪拌18~24h，充分攪勻；

　　

　　3、透析或過柱層析。

　　

　　這里需要注意FITC熒光標記抗體的操作過程注意避光，攪拌速度應(yīng)適當避免氣泡的產(chǎn)生；層析柱裝柱注意正確操作，使柱體均勻、柱面平整，無氣泡、裂隙。