免疫系統(tǒng)是由先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)組成的保護機體免受外界病原體侵害的系統(tǒng)。硬骨魚類生活在病原菌豐富的水環(huán)境中，廣泛接觸多種病原菌，先天免疫系統(tǒng)在硬骨魚類中發(fā)揮著更為重要的作用。吞噬作用是先天性免疫應答的重要機制之一，它通過吞噬細胞吸收病原體，降解攝入的病原體，激活免疫應答。這一進展始于模式識別受體（PRRs）對病原體的識別，PRRs包括凝集素、Toll樣受體、NOD樣受體和B類清道夫受體以及其他受體。B類清道夫受體參與了吞噬作用，但對其在硬骨魚類中的作用的認識還很有限。B類清道夫受體包括CD36、SR-B和溶酶體整合膜蛋白2（LIMP-2），LIMP-2在溶酶體和晚內(nèi)切體的限制膜中的表達，LIMP-2的過度表達導致了早內(nèi)切體和晚內(nèi)切體/溶酶體的增大，一些研究已經(jīng)報道LIMP-2在哺乳動物中的免疫作用，但是LIMP-2在硬骨魚類中的免疫作用還不清楚。

大菱鲆是我國海水養(yǎng)殖為廣泛的魚類之一，?；加婿牷【秃ｋ噫溓蚓腥镜燃毦约膊?。為了制定防治措施，青島農(nóng)業(yè)大學楊寧教授科研團隊對大菱鲆細菌感染過程中的免疫相關(guān)基因及其相關(guān)活性進行了研究，此外，黏膜免疫反應是宿主防御的第yi道防線，對于生活在病原菌豐富的水生環(huán)境中的水生生物更為重要。更好地了解黏膜免疫反應有助于通過浸泡或喂養(yǎng)來制定疾病控制和預防措施。基于以上問題，作者試圖描述大菱鲆的LIMP-2基因結(jié)構(gòu)、不同細菌感染后粘膜組織中LIMP-2的表達情況，以及LIMP-2的微生物配體結(jié)合活性和凝集活性，以初步了解其在硬骨魚類中的免疫作用。

基本信息

題目：

Identification and initial functional characterization of lysosomal integral membrane protein type 2 (LIMP-2) in turbot (Scophthalmus maximus L.)

期刊：Developmental & Comparative Immunology

影響因子：3.119

PMID：31176756

作者單位：青島農(nóng)業(yè)大學

索萊寶合作產(chǎn)品：

摘要

免疫系統(tǒng)保護生物體免受外來病原體的侵害，這一進展始于模式識別受體（PRRs）對病原體的識別。B類清道夫受體作為PRRs的一種，在吞噬功能中發(fā)揮著重要作用。在三種B類清道夫受體中，LIMP-2被報道存在于溶酶體和晚內(nèi)切體的限制膜中，但是它在硬骨魚種中的免疫作用仍然局限于少數(shù)物種。在此，作者對大菱鲆LIMP-2基因進行了研究，分析了LIMP-2基因在不同細菌感染后黏膜屏障中的表達模式以及LIMP-2與不同微生物配體的結(jié)合活性和與不同細菌的凝集活性。作者鑒定出一個具有1593 bp開放閱讀框（ORF）的SmLI

MP2基因，多個物種的比較和系統(tǒng)進化樹分析表明，該基因與牙鲆的親緣關(guān)系密切，基因組結(jié)構(gòu)和共線性分析顯示了LIMP-2在進化過程中的保守性。在組織分布分析中，SmLIMP-2在所有被檢測的大菱鲆組織中均有表達，其中腦組織表達水平高，肝組織表達水平低。此外，SmLIMP-2在革蘭氏陰性菌鰻弧菌感染后所有粘膜組織（皮膚、鰓和腸）中均顯著上調(diào)，在革蘭陽性菌鏈球菌感染后的鰓中上調(diào)。后，rSmLIMP-2與所檢測的所有微生物配體均表現(xiàn)出較強的結(jié)合能力，并與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌有較強的凝集作用。綜上所述，該研究結(jié)果表明SmLIMP-2在魚類對細菌感染的免疫反應中起著重要作用。然而，需進行進一步功能研究，以更好地描述其在硬骨魚類免疫中的詳細作用。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1.大菱鲆LIMP2基因的鑒定

分子克隆后，獲得一個具有1593bp開放閱讀框（ORF）的SmLIMP2基因（GenBank登錄號：MH748107）。ORF編碼530個氨基酸殘基，預測分子質(zhì)量為59.95kDa，理論等電點為6.44。推測得到的SmLIMP2蛋白具有9個蛋白激酶C磷酸化位點、11個酪蛋白激酶II磷酸化位點和10個N-糖基化位點。此外，推測得到的SmLIMP2蛋白有55個帶負電的殘基（Asp+Glu），52個帶正電的殘基（Arg+Lys），不穩(wěn)定性指數(shù)為37.18，脂肪族指數(shù)為87.49。與其它物種相比，SmLIMP2基因與褐牙鲆的相似性高，為97.0%，其次是大黃魚94.9%，虹鱒94.5%，而與褐牙鲆的同源性高，為92.5%，其次是大黃魚89.6%，半滑舌鰨94.5%。

Table 2

2.SmLIMP2基因的基因組結(jié)構(gòu)分析

作者利用大菱鲆基因組數(shù)據(jù)庫研究了SmLIMP2的基因組結(jié)構(gòu)，并與已發(fā)表的LIMP2基因?qū)Ρ攘送怙@子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。作者發(fā)現(xiàn)有趣的是，在人、鼠和雞中的LIMP2有12個外顯子，而硬骨魚類有13個外顯子。而且，人和小鼠的12個外顯子*相同，而雞中只有兩個外顯子是與人和鼠是不同的。此外，在硬骨魚類含有的13個外顯子中，大菱鲆和斑馬魚只有1個外顯子不同，大菱鲆和鯰魚只有2個外顯子不同，斑馬魚和鯰魚只有1個外顯子不同。

Figure 1

3.系統(tǒng)進化樹分析

作者利用MEGA 6對不同物種LIMP2的氨基酸序列進行了系統(tǒng)進化樹分析。結(jié)果顯示，SmLIMP2先與褐牙鲆聚集，然后依次與大黃魚、半滑舌鰨、虹鱒聚集。另一個進化枝由鯉魚（C. carpio）、斑馬魚（D. rerio）和斑點叉尾鮰（I. punctatus）組成。其他較高等的脊椎動物形成了單個進化分支，包括人（H. sapiens）、小鼠（M. musculus）、雞（G.gallus）和熱帶爪蟾（X. tropicalis）。

Figure 2

4.SmLIMP2基因的共線性分析

 通過共線性分析進一步驗證了SmLIMP2的鑒定。結(jié)果顯示，從哺乳動物到脊椎動物的物種中都觀察到了LIMP2的相同相鄰基因。其中在大菱鲆、鯰魚、雞、小鼠和人中觀察到SmLIMP2的鄰近基因都包含158個螺旋結(jié)構(gòu)域（CCDC158）、序列相似家族47成員E（FAM47E）和具有EF-hand結(jié)構(gòu)域2的蛋白磷酸酶（PPEF2）。然而，N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（NAAA）只在鯰魚、雞、小鼠和人中觀察到。

Figure 3

5.SmLIMP2的組織分布

作者采用Real-time PCR的方法，研究了SmLIMP2在大菱鲆皮膚、鰓、腸、血、肝、脾、頭腎、腦等8種健康組織中的組織分布規(guī)律。結(jié)果顯示，SmLIMP2在所有被檢測的組織中廣泛表達，其中，在腦中表達水平高（26.44倍），其次是腸（9.93倍）和皮膚（6.03倍），而在肝臟中表達水平低（對照）。

Figure 4

6.細菌攻擊后SmLIMP2的表達譜

為了研究SmLIMP2在大菱鲆粘膜組織中的免疫作用，作者用革蘭氏陽性菌S.iniae和革蘭氏陰性菌V.anguillarum浸泡攻擊大菱鲆后，檢測了SmLIMP2在大菱鲆粘膜組織（鰓、皮膚和腸）中的表達譜。

在感染S.iniae后，SmLIMP2只在鰓中上調(diào)，在皮膚和腸中下調(diào)，具體表現(xiàn)為：在腮中，4h快速上升6.97倍，8h快速上升4.06倍，12h迅速恢復到基礎水平；在腸中，2h下降幅度大，達0.17倍，其余時間點迅速恢復到基礎水平。在皮膚中，SmLIMP2在2小時下調(diào)0.37倍，8小時下調(diào)0.68倍。

在V.anguillarum感染后，三種組織中SmLIMP2的表達情況均上調(diào)。具體表現(xiàn)為：在腮中，在2小時時檢測到高的上調(diào)，上調(diào)幅度為7.52倍。在皮膚中，在2小時時上調(diào)4.68倍，在12h時上調(diào)4.34倍。

Figure 5

Figure 6

7.微生物配體的體外結(jié)合

在表達譜分析之后，作者又研究了SmLIMP2與微生物配體的結(jié)合能力。rSmLIMP2是從大腸桿菌中純化出來的一種天然His標記蛋白，并且只有SmLIMP2的胞外區(qū)被誘導，在western blot分析中，只觀察到一條分子量為50kDa的帶。后，研究了SmLIMP2與微生物配體和虹彩病毒（iridovirus）的結(jié)合能力，具體表現(xiàn)為：對照蛋白與被測配體沒有任何結(jié)合能力，而rSmLIMP2對LPS的結(jié)合能力強，其次是iridovirus、PGN和LT。PGN和LTA均在4μg/ml時達到峰值，而LPS和iridovirus均在8μg/ml時達到峰值。

Figure 7

Figure 8

8.凝集試驗

作者用凝集試驗進一步鑒定LIMP2的免疫功能。在含鈣的TBS緩沖液中的凝集試驗表明，rSmLIMP2能夠引起大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌強烈的凝集，其中，大腸桿菌和鰻弧菌的凝集作用更強。

研究結(jié)論

綜上所述綜合基因組結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化樹和共線性分析，作者驗證了SmLIMP-2的鑒定，并表明其與相應的脊椎動物物種顯示出很強的同源性。LIMP-2在大菱鲆腸道和皮膚中的大量表達可能提示LIMP-2在大菱鲆黏膜免疫中的重要作用，但是由于LIMP-2在硬骨魚類中的信息有限，需要進一步研究LIMP-2在不同組織和不同類型細胞中的表達水平。鰻弧菌感染后大菱鲆三種粘膜組織SmLIMP-2的表達均上調(diào)，作為模式識別受體（PRRs）的一員，黏膜組織中SmLIMP-2的快速上調(diào)提示了大菱鲆對細菌感染的病原體識別和宿主免疫激活。rSmLIMP2與LPS、PGN和LTA等微生物配體呈劑量依賴性結(jié)合，與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌有較強的凝集作用，根據(jù)之前的研究，這一結(jié)果暗示著LIMP-2可能參與病原體識別、抗原提呈、巨噬細胞活化和炎癥過程。然而，LIMP-2在硬骨魚類中的應用還很有限，需要進一步研究以更好地描述其在硬骨魚類免疫中的具體作用。

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