結(jié)腸癌（CRC）是目前流行的癌癥之一。盡管化療和生物制劑產(chǎn)生積極的療效，但晚期CRC對大多數(shù)人仍然具有致命性。錯配修復(fù)缺陷的CRC對免疫檢查點封鎖（ICB）的反應(yīng)引起了人們對將免疫療法應(yīng)用于錯配修復(fù)的CRC的興趣。癌胚抗原（CEA）是一種在多種常見癌癥中表達的腫瘤相關(guān)抗原（TAA），是一種廣泛應(yīng)用的腫瘤疫苗免疫靶點。

癌癥疫苗功效的局限性在于活化的T細胞對腫瘤的浸潤程度不高，以及對那些能夠轉(zhuǎn)移到腫瘤的T細胞免疫檢查點的上調(diào)。為改進這一問題，都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院（都醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)院）院長助理、腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室主任任軍教授及其團隊提出了一種假設(shè)并得到證實，他們提出癌癥疫苗與免疫檢查點抑制劑的組合可能誘導(dǎo)更有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。此前，他們曾報道過Ad-HER3疫苗接種可能會改變浸潤性T細胞的表型，并對小鼠乳腺癌模型中的免疫檢查點抑制產(chǎn)生反應(yīng)，在本次研究中他們研究了抗PD-1治療聯(lián)合Ad-CEA疫苗治療在小鼠結(jié)腸癌模型中誘導(dǎo)T細胞功能、細胞因子分泌和抗腫瘤免疫活性上大于任何一種單獨的方法。

題目：

Impact of synchronized anti-PD-1 with Ad-CEA vaccination on inhibition of colon cancer growth

期刊：Immunotherapy

影響因子：3.028

PMID：31192764

作者單位：都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院

目的：探討抗PD-1抗體的加入是否能提高Ad-CEA免疫小鼠結(jié)腸癌模型的免疫原性和抗腫瘤活性。方法：植入MC-38-CEA細胞前給予Ad-CEA，然后給予抗PD-1抗體。流式細胞儀和ELISPOT檢測CEA特異性T細胞反應(yīng)。采用脾細胞與腫瘤細胞動態(tài)共培養(yǎng)的方法，分析其抗腫瘤活性。用IHC法檢測淋巴細胞對腫瘤的浸潤。記錄腫瘤體積和總生存率。結(jié)果：Ad-CEA聯(lián)合抗PD-1抗體具有較強的抗腫瘤活性。聯(lián)合用藥也增加了T細胞浸潤，但降低了Tregs。結(jié)論：Ad-CEA疫苗聯(lián)合抗PD-1抗體可增強抗腫瘤活性和免疫應(yīng)答。

1. Ad-CEA的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移效率

為檢測Ad-CEA感染細胞和表達CEA的能力，用Ad-CEA-Luci感染NIH3T3細胞，檢測其熒光素酶和CEA的表達。NIH3T3細胞的體外BLI顯示熒光素酶信號呈病毒劑量依賴性增加（圖1A）。在沒有病毒的情況下沒有檢測到任何信號。CEA蛋白表達呈相似的病毒劑量依賴關(guān)系（圖1B）。注射到在C57BL/6小鼠足墊處后，主要在注射部位或注射部位檢測到癌胚抗原-熒光素（圖1C&D）。在顯微鏡下觀察器官的組織形態(tài)學(xué)，證實了Ad-CEA的安全性，因為在器官中沒有觀察到細胞病變作用。

2. Ad-CEA疫苗體內(nèi)誘導(dǎo)抗CEA免疫應(yīng)答的研究

用遞增劑量的Ad-CEA免疫C57BL/6小鼠，以評估CEA特異性細胞和體液免疫反應(yīng)。如圖2A所示，隨著病毒劑量的增加，CEA特異性T細胞的數(shù)量增加（在脾細胞中）；然而，CEA抗體的滴度在較低劑量的Ad-CEA時趨于穩(wěn)定狀態(tài)（圖2B）。這些數(shù)據(jù)表明，抗體和T細胞應(yīng)答均由AD-CEA激活，但對大刺激的劑量要求不同。

3. Ad-CEA和抗PD-1抗體聯(lián)合治療可改善結(jié)腸癌小鼠模型的預(yù)后

為了評價抗PD-1抗體聯(lián)合Ad-CEA疫苗對荷瘤小鼠的療效，作者比較了未經(jīng)治療或經(jīng)Ad-CEA、PD-1抗體和PD-1抗體聯(lián)合Ad-CEA疫苗治療的小鼠的腫瘤生長情況（圖3A）。通過熒光成像（FLI）（圖3B）和物理測量（圖3C），與其他治療組相比，PD-1抗體與Ad-CEA合用，腫瘤的生長明顯減少。聯(lián)合治療組的平均腫瘤體積為1.73cm³，未治療對照組的平均腫瘤體積為6.42cm³。在腫瘤細胞接種后的第60天，對免疫小鼠的存活率進行監(jiān)測（圖3D）。與對照組或單純Ad-CEA治療組相比，抗PD-1單藥治療提高了小鼠的生存率。聯(lián)合治療使中位生存期延長45天。作者用H&E染色評價了各器官的組織學(xué)和細胞形態(tài)學(xué)。不同器官的HE染色均無明顯的組織學(xué)異常和細胞形態(tài)學(xué)異常，提示治療方法安全，對小鼠無毒性作用（圖3S）。

4. Ad-CEA與抗PD-1聯(lián)合可減少Treg細胞并增強效應(yīng)T細胞反應(yīng)

為了闡明PD-1阻斷劑增強Ad-CEA抗腫瘤活性的免疫機制，作者先對不同組分小鼠腫瘤和脾細胞中T淋巴細胞的組成進行了研究。與對照組相比，接受Ad-CEA+抗PD-1聯(lián)合治療的小鼠的CD4+TIL總頻率增加（圖4A）。CD8+TILs的頻率有增加的趨勢（圖4S-C）。在脾細胞內(nèi)，與對照組相比，單獨用Ad-CEA治療的小鼠的CD8+T細胞增加，但CD4+T細胞沒有增加（圖）。Ad-CEA聯(lián)合抗PD-1可增加CD4+T細胞和CD8+T細胞（圖5B）。此外，疫苗與PD-1抗體的結(jié)合顯著降低了腫瘤和脾臟中Tregs的頻率（圖4D和5C）。與所有其他實驗組相比，用該組合物治療的小鼠的脾細胞顯示出明顯更高的IFN-γ水平（圖5D）和分泌IFN-r的抗原特異性淋巴細胞應(yīng)答（圖5F）。聯(lián)合用藥也能誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中IFN-r和GranB的高表達（圖4C和4E）。

PD-1阻斷后，PD1+CD8+T細胞百分比增加（圖5E）。相反，PD-L1在腫瘤組織中的表達在兩組之間沒有任何差異（圖4S-D）。與腫瘤細胞共培養(yǎng)的圖像分析顯示，聯(lián)合治療后淋巴細胞的細胞溶解作用更強（圖6）。這些數(shù)據(jù)表明，用抗PD-1抗體和癌癥疫苗聯(lián)合治療小鼠可減少腫瘤浸潤treg并增強荷瘤小鼠T細胞的效應(yīng)功能。

5.Ad-CEA聯(lián)合抗PD-1對荷瘤小鼠血清細胞因子的影響

為探討Ad-CEA聯(lián)合抗PD-1抗腫瘤作用的關(guān)鍵因素，使用Luminex多重免疫分析法對四個實驗組中每組小鼠血清樣品中的細胞因子水平進行了分析。與對照組相比，Ad-CEA和抗PD-1抗體的組合可顯著提高血清IL-2，IL-12和CCL5的水平，并降低IL-10和TNF-α的水平（圖7）。

本研究團隊在小鼠結(jié)腸癌模型中證實了Ad-CEA腫瘤疫苗和抗PD-1的聯(lián)合抗腫瘤作用，表明了系統(tǒng)性抗原特異性抗腫瘤免疫的發(fā)展。Ad-CEA和抗PD-1聯(lián)合應(yīng)用可以克服單一藥物治療的局限性。在晚期疾病之前進行免疫接種可能產(chǎn)生大的效益。