DH5α感受態(tài)細(xì)胞
品牌:Solarbio | 貨號(hào):C1100
本公司生產(chǎn)的DH5α感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌DH5α菌株經(jīng)特殊工藝制備得到,可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè),轉(zhuǎn)化效率可達(dá)108,-70℃保存3-5個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
基因型: supE44△lacU169(φ80 lacZ△M15)hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1
特 點(diǎn): 一種用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷的抑制型菌株。其φ80 lacZ△M15基因的產(chǎn)物可與pUC載體編碼的 β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)β互補(bǔ),可用于藍(lán)白斑篩選。
操作方法:(以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行)
1、將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化,以下實(shí)驗(yàn)以100ul感受態(tài)細(xì)胞為例。
2、向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入需轉(zhuǎn)化的目的DNA,注意目的DNA的體積不要超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞懸 液體積的十分之一,輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物,冰浴放置30分鐘。
3、將離心管置于42℃水浴中60-90秒,然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中放置2-3分鐘,注意不要搖動(dòng)離 心管。
4、向離心管中加入500ul無(wú)菌無(wú)抗的SOC或LB培養(yǎng)基,37℃ 180rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。目的是 使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá),使菌體復(fù)蘇。
5、取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布含相應(yīng)抗生素的SOC或LB平板,37℃倒置培養(yǎng)12-16小 時(shí)。涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)調(diào)整,如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多,可取100ul左右的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 涂板;反之,如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少,可取200-300ul的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板。過(guò)多菌液可以抑 制細(xì)菌生長(zhǎng)。如果預(yù)計(jì)的克隆較少,可通過(guò)離心后吸除部分培養(yǎng)液,懸浮菌體后將其涂布 于一個(gè)平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存,如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少,可以將剩下的 菌液再涂布新的平板。
注意事項(xiàng):
1、感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃,不可反復(fù)凍融,否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低。
2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作,防止其它DNA或雜菌的污染,避免為以后的篩選、鑒定帶來(lái)影響。
3、轉(zhuǎn)化時(shí),轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一。
4、轉(zhuǎn)化率的計(jì)算:轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。
5、為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功,可以保留部分連接產(chǎn)物,以重新轉(zhuǎn)化,將損失降到低。