本試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定樣品中人P16蛋白的水平。向預(yù)先包被了人P16蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入P16蛋白，溫育；洗滌后，加入HRP標(biāo)記過的P16蛋白抗體。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中人P16蛋白的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成

1	標(biāo)準(zhǔn)品（16μg/ml）	0.5ml	7	顯色劑A液	6ml
2	標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液	3ml	8	顯色劑B液	6ml
3	酶標(biāo)包被板	12孔×8條	9	終止液	6ml
4	酶標(biāo)試劑	6ml	10	說(shuō)明書	1份
5	30倍濃縮洗滌液	20ml	11	封板膜	2張
6	樣品稀釋液	6ml	12	密封袋	1個(gè)

需要而未提供的試劑和器材

1． 37℃恒溫箱。

2．標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。

3．精密移液器及一次性吸頭

4．蒸餾水，

5．一次性試管

6．吸水紙

注意事項(xiàng)

1．從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差

3．建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測(cè)。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再按說(shuō)明書操作進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

4．嚴(yán)格按照說(shuō)明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

5．為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。

6．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

7．底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中

標(biāo)本要求

1．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

操作程序

1．標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶請(qǐng)按照說(shuō)明自行在小試管中倍比稀釋）：

8μg/ml	（5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
4μg/ml	（4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	120μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2μg/ml	（3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	120μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1μg/ml	（2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	120μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0.5μg/ml	（1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品）	120μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2．分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl；在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。輕輕晃動(dòng)混勻，37℃溫育30分鐘。

3．棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次，拍干。

4．每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動(dòng)混勻，37℃溫育30分鐘。

5．棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次，拍干。

6．每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

7．取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

8．測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

9．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的，其實(shí)際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù)。

操作程序總結(jié)：

準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘

加入終止液

15分鐘之內(nèi)讀OD值

計(jì)算

檢測(cè)范圍：0.2μg/ml→10μg/ml。

規(guī)格： 96T/盒

保存： 2-8℃

有效期： 6個(gè)月（2-8℃）。

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