常見問題
未回收或回收率低
可能原因
膠塊未全部溶解
建議解決方案
溶解凝膠時應(yīng)該置于65℃水浴,不斷上下顛倒,確定膠塊*溶解后再進(jìn)行下一步操作。如果凝膠濃度較大,可增加溶膠液使用量。
可能原因
膠塊太大(>400mg)
建議解決方案
如果需要處理的膠塊太大,應(yīng)該先將其切成小塊,做兩次回收或選用大量型回收試劑盒。
可能原因
電泳緩沖液pH過高
建議解決方案
硅膠膜在高鹽低pH值時可結(jié)合DNA,在低鹽高pH值條件下洗脫。如果電泳緩沖液pH值太高,會導(dǎo)致DNA無法結(jié)合或降低結(jié)合率,可在溶膠后加入3M NaAc (pH5.2),將pH值調(diào)7.0以下。
可能原因
漂洗液中未加入無水乙醇
建議解決方案
*次使用之前應(yīng)該在漂洗液中加入無水乙醇。漂洗液每次用后應(yīng)該擰緊瓶蓋,以免乙醇揮發(fā),降低回收率。
可能原因
洗脫液不合適
建議解決方案
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫,如TE和水;洗脫液pH值過低會降低洗脫效率,應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間,當(dāng)用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi);洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱,加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘,可提高洗脫效率。
可能原因
洗脫液加入位置不正確
建議解決方案
洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位,確保洗脫液能*覆蓋硅膠膜的表面以達(dá)到大洗脫效率。
可能原因
洗脫體積太小
建議解決方案
洗脫液體積若小于30μl,則不易*浸透硅膠膜,使洗脫效率降低;洗脫液體積若超過200μl,則所得的DNA濃度會降低,但DNA總量不會減少。為了得到較高的洗脫效率可以適當(dāng)增大洗脫液體積。
可能原因
洗脫時間過短
建議解決方案
洗脫時間對回收率也會有—定影響,洗脫時放置2分鐘可達(dá)到較好的效果。
常見問題
回收后的片斷無法用于后續(xù)試驗,如連接等
可能原因
乙醇?xì)埩?nbsp;
建議解決方案
洗脫時硅膠膜上有漂洗緩沖液殘留,會使洗脫產(chǎn)物中含乙醇,影響下游操作,在洗脫之前可通過再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘,*去除漂洗緩沖液中的乙醇。
可能原因
洗出液中污染有瓊脂糖
建議解決方案
凝膠未全部溶解
可能原因
洗脫產(chǎn)物有ssDNA,表現(xiàn)為在瓊脂糖電泳上呈現(xiàn)小的彌散帶。
建議解決方案
將洗脫產(chǎn)物95℃加熱2分鐘,慢慢冷卻到室溫,使單鏈DNA重新退火復(fù)性即可。